在海藻酸鈉凝膠上誘導骨髓間充質干細胞分化為血管內皮細胞的研究＊

胡 帥，王 嫣△，陳小菊，周 蘭，陳文直

（1.重慶醫科大學生物醫學工程系超聲醫學工程/重慶市市級重點實驗室 400016；2.重慶醫科大學護理學院 400016；3.重慶醫科大學檢驗系 400016）

種子細胞的來源及如何為組織工程化器官提供血供是目前血管組織工程面臨的兩大關鍵問題［1］。血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VEC）作為血管組織的種子細胞是組織工程化血管的核心，是血管外科和心臟外科血管移植物的主要材料，但其來源較困難，自體細胞不易獲取，體外擴增能力有限，異體細胞存在免疫原性而較難應用。骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）獲取容易，來源廣泛，且具有多向分化潛能，是目前組織工程種子細胞的研究熱點。而如何采用干細胞體外誘導分化，產生大量血管內皮細胞一直是該研究領域的焦點和難點［2］。目前國內外均能在體外誘導BMSCs分化為VEC，但其在培養瓶中培養，細胞只能在平面生長，不利于立體組織的形成；且在誘導后移植過程中又有諸多不便。因此尋找一種既能使細胞在其上生長形成立體血管組織、又便于后續組織工程化血管移植的載體就非常重要。海藻酸鈉凝膠具有無毒性、生物相容性良好和凝膠過程溫和等特點，而且在本課題組的前期研究中證實了海藻酸鈉凝膠對BMSCs生長及向成骨細胞分化均有促進作用［3－4］，由此作者首先進行在平面海藻酸鈉凝膠上誘導BMSCs分化為VEC的初步研究，以探討誘導BMSCs在海藻酸鈉凝膠上向VEC分化的可行性，并為之后BMSCs在三維立體海藻酸鈉凝膠上分化為VEC，并進一步形成血管組織打下良好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料 清潔級 Wistar大鼠購于重慶醫科大學動物中心，雄性，1個月齡，體質量80g左右。海藻酸鈉購于挪威Novamatrix公司，α－MEM培養基和胎牛血清購于美國 Hyclone公司，RNA試劑盒、隨機引物 （Olig dT）及逆轉錄酶（M－MLV）購于鼎國生物技術責任有限公司，重組大鼠血管內皮細胞生長因子 （VEGF）購于美國R＆D公司，抗第Ⅷ因子相關抗原 （vWF）抗體購于英國Abcam公司，羅丹明標記山羊抗兔二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司，CaCl2、甲苯胺藍為重慶無機化學試劑廠產品，內皮素－1（ET－1）引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。原代細胞提取沖洗液為α－MEM、10%胎牛血清、10%青霉素/鏈霉素等，完全培養液為α－MEM、10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素等。內皮細胞誘導培養液為α－MEM、10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、10ng/mL VEGF等。

1.2方法

1.2.1BMSCs分離、純化和擴增［3］將1個月齡 Wistar大鼠斷頸處死，浸泡于75%乙醇中5min，無菌取出大鼠四肢骨，盡量除去四肢骨上附著的肌肉和筋膜等雜質，用含普通培養液中所含抗菌藥10倍量的原代細胞提取沖洗液將骨髓沖入離心管，1 000r/min離心5min，用完全培養液重懸后，以5×106個的細胞數接種入250mL塑料培養瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。24h后首次更換培養液，以后每2～3天換液1次。6～7d細胞長滿瓶底90%，用含10mmol/L EDTA的0.1%胰蛋白酶消化，重懸浮細胞，并以5×105個的細胞數接種于培養瓶中傳代，2～3d更換培養液。傳至第2代備用。

1.2.2平面海藻酸鈉凝膠的制備［3］用0.1%PBS配制6%海藻酸鈉水溶液，攪拌均勻，高溫、高壓（120℃、0.15MKp）滅菌，4℃備用；種入細胞前用α－MEM稀釋，終濃度為3%。吸取3%海藻酸鈉水溶液700μL滴入12孔塑料培養板孔內，在孔內形成約1mm厚度的圓盤，再滴入0.1%CaCl22mL于圓盤上，靜置40min。待凝膠形成后棄去CaCl2，改用2mLα－MEM浸泡，放入4℃冰箱，每24小時換液1次，72h后用于細胞培養。

1.2.3誘導分化 將2或3代BMSCs以1×105個/孔接種于已制備的平面海藻酸鈉凝膠上，采用內皮細胞誘導培養液培養。

1.2.4免疫熒光化學染色 細胞爬片vWF免疫熒光化學染色，未誘導BMSCs作為陰性對照。細胞在誘導到第12天后做細胞爬片，用4%多聚甲醛固定；3%H2O2去離子水孵育5～10min以清除內源性過氧化物酶活性；用蒸餾水沖洗，0.1M PBS浸泡5min；滴加10μL正常山羊血清封閉液，室溫下孵育15min傾去；滴加10μL適當稀釋的一抗（抗vWF抗體），37℃孵育2～3h，PBS沖洗3次，每次3min；加入羅丹明標記山羊抗兔二抗，37℃避光孵育2～3h，PBS沖洗同前；用甘油封片；熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.2.5免疫組化染色 以 Wistar大鼠舌組織石蠟包埋切片的血管vWF免疫組化染色為陽性對照，未誘導BMSCs作為陰性對照。細胞在誘導到第12天做細胞爬片后，用4%多聚甲醛固定。標本與Wistar大鼠舌組織石蠟包埋血管切片及未誘導的BMSCs細胞爬片同時進行免疫組化染色：用3%H2O2去離子水孵育5～10min以清除內源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，0.1MPBS浸泡5min；滴加10μL正常山羊血清封閉液，室溫下孵育15min傾去；滴加10μL適當稀釋的一抗（抗vWF抗體），37℃孵育2～3h，PBS沖洗3次，每次3min；滴加生物素化二抗工作液，室溫下孵育15min；PBS沖洗同前；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育15min；PBS沖洗后DAB顯色劑顯色；用自來水充分沖洗后脫水，透明，封片。

1.2.6RT－PCR檢測 ET－1表達 提取培養12d細胞的總RNA進行RT－PCR檢測，ET－1基因引物序列為：5′－AGG AGT GTG TCT ACT CTG CCA CC－3′，5′－CGA AAG GAG GTC TTG ATG CTG TTG C－3′，擴增產物為383bp。

2 結 果

2.1免疫熒光化學染色和免疫組化染色檢測結果 vWF在熒光顯微鏡觀察下，細胞胞漿發出紅色熒光（插頁Ⅰ圖1），且為強陽性。用鼠舌組織作為vWF免疫組化染色的陽性對照，其血管內皮胞漿染為棕黃色；爬片上誘導后的細胞可見部分細胞胞漿染色陽性（插頁Ⅰ圖2）。未誘導的BMSCs兩種檢測結果均為陰性。

圖1 vWF免疫組化染色結果（×200）

圖2 vWF免疫熒光化學染色結果（×200）

2.2ET－1的表達 BMSCs被誘導培養12d后ET－1表達陽性（圖3）。

圖3 BMSCs分化為VEC的相關基因表達結果

3 討 論

到目前為止，能夠用于臨床的組織工程產品數量非常有限，僅局限于幾種皮膚和軟骨的組織工程產品。其中主要原因之一就是組織工程的血管化問題難以解決。一般認為細胞在血管周圍150～200μm內才能通過彌散來維持存活［5］。如果不能建立內在的血液循環，組織工程化組織細胞將在短期內大量死亡，進而導致構建組織工程化組織失?。?］。要構建有一定體積的三維組織工程化組織，就必須考慮早期血管化這一關鍵問題。

目前構建組織工程化血管的途徑有［6］：（1）構建毛細血管網。應用單層VEC植入合成材料內壁，構建出明顯的毛細血管網。但這種VEC屬于已成熟細胞，其分裂增殖能力低下且還存在去分化的傾向，致使管壁中段內皮細胞有時不完全，平滑肌生長也不完整。（2）體內埋植構建軸向血管。將組織工程化組織植入機體的皮下、肌內或骨膜下等區域，該區域必須包含有一定管徑的血管，達到可以用顯微外科方法吻合。但此法容易損傷預構區組織，帶來各種并發癥，此外二次轉瓣和吻合時對組織工程化組織新生血管是有創傷的，不利于組織再生。以上途徑均面臨技術上急需解決的關鍵問題，血管化成功率較低，因此找尋更為優良的種子細胞并于體外構建完善的血供體系是當前研究的熱點。

BMSCs作為種子細胞的作用備受重視，其具有其他細胞所不可比擬的優越性：（1）從自身骨髓培養擴增的BMSCs誘導為VEC不存在組織相容性問題；即使是同種異體，BMSCs也屬于未分化的前體干細胞，具有免疫獨特性，其細胞表型的分化尚不成熟，移植的排斥反應較弱。（2）BMSCs具有旺盛的增殖分化潛能，多次傳代后仍然保持相同形態和無接觸抑制的特點［7］，并且在無誘導劑情況下，可保持25代內無分化趨勢。郭新和李玉林［8］認為利用BMSCs進行血管內皮構建，可促進工程化器官的血管再生、機體缺血性疾病的治療，同時也解決了再生小口徑血管（＜5mm）易發生血栓的問題，具有廣闊的應用前景。加之骨髓作為BMSCs的來源具有易獲取、BMSCs易分離、體外培養條件要求不高等特點，因此被認為是血管組織工程種子細胞的理想來源［9］。有學者提取BMSCs經VEGF、表皮生長因子和皮質醇激素誘導3周，同樣誘導出具有內皮特性的細胞，并發現有一些細胞因子分泌［10］。Liang和Wang［11］應用VEGF和堿性成纖維生長因子誘導BMSCs后發現，細胞形成血管腔樣結構，周圍有成鋪路石樣排列的內皮樣細胞。以上研究結果均提示BMSCs可向VEC分化。

但是在之前的研究中采用的平面培養系統，不利于立體血管組織的形成；且在誘導后移植過程中又有諸多的不便。因此需要尋找一種既能使細胞在其上生長形成立體組織，且便于后續組織工程化血管移植的載體。海藻酸鈉凝膠具有良好的生物相容性，即無毒性、不致敏、不致癌和不致畸，植入后也無免疫原性，同時具有良好的可塑性，能被方便加工成所需的形狀，以形成符合設計外形的新組織，因此得到了越來越多專家和學者的重視和應用［12］。Sasa等［13］采用海藻酸鈉凝膠作為微球載體，在其上對人BMSCs培養及定向分化進一步證實了海藻酸鈉凝膠載體對BMSCs生長、增殖及誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞過程中的促進作用。本課題組前期研究表明，BMSCs在海藻酸鈉凝膠上能很快適應微環境改變，迅速黏附、貼壁進入增殖期，并且能促進BMSCs誘導分化為成骨細胞［3－4］。因此作者進一步嘗試在海藻酸鈉凝膠上誘導BMSCs分化為VEC，初步探討在海藻酸鈉凝膠上形成立體血管網的可行性。

目前鑒定VEC的特征性標志，包括vWF、CD31、KDR（又稱 VEGFR－2）、fit－1、Tie－1、Tie－2和 VE－鈣黏素、ET－1等，早期還表達CD34抗原［14］。本研究選擇了2種因子（vWF和ET－1）分別進行檢測，對vWF的表達進行免疫組化染色和免疫熒光化學染色，發現在海藻酸鈉凝膠上誘導12d的細胞經免疫組化染色為棕黃色，免疫熒光化學染色呈紅色，證明誘導的細胞中分泌vWF。ET－1屬于內皮素家族，是由21個氨基酸組成的多肽，是已知的最有力的內源性血管收縮因子，它主要由血管內皮產生并介導包括血管收縮、白細胞激活和細胞增生（血管重構）等一系列反應，血管VEC通過釋放ET收縮血管和促進VEC增殖［15］。本研究結果顯示，ET－1表達為陽性，也進一步提示BMSCs已經分化為VEC。這一結果也顯示了海藻酸鈉凝膠不影響BMSCs向VEC分化。

本研究結果初步證實了在平面海藻酸鈉凝膠上BMSCs能夠定向誘導分化為VEC，為進一步研究BMSCs在三維立體海藻酸鈉凝膠上向VEC分化進而形成便于移植的血管組織打下堅實的實驗基礎。

綜上所述，以VEGF為誘導劑可以將BMSCs在海藻酸鈉凝膠上成功地誘導為VEC，為組織工程血管化提供獲取方便、可以大量擴增種子細胞，同時也為海藻酸鈉凝膠成為組織工程化血管形成過程中可選擇的、較好的支架提供了實驗依據。

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