血管內皮生長因子在門靜脈高壓大鼠腹水形成中的作用＊

趙永忠，漆志平，周英瓊，霍 群，韋錚武，侯巧燕

（桂林醫學院：1.附屬醫院消化內科；2.碩士研究生；3.附屬醫院病理科，541001；4.生化教研室 541004）

腹水是肝硬化患者最突出的臨床表現，同時也是提示肝硬化患者預后不良的因素之一。門靜脈高壓、低清蛋白血癥及腎功能不全常是引起肝硬化患者腹水形成的主要原因。新近研究表明，門靜脈高壓在肝硬化腹水形成中起主導作用［1］。然而門靜脈高壓導致腹水形成的原因尚未徹底闡明。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前發現的最強的增強血管通透性的物質之一，又是血管發育、成熟的病理生理過程中最重要的血管生成因子。作者以前的研究表明，VEGF在門靜脈高壓大鼠模型中胃組織的表達是增高的［2］。本研究中作者利用滲透性改變復制門靜脈高壓大鼠腹水模型，同時進一步探討門靜脈高壓狀態下VEGF與腹水形成的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 56只成年雄性SD大鼠，由日本福岡大學醫學部實驗動物中心提供，體質量220～240g。隨機分為3組：門靜脈結扎（portal vein ligation，PVL）組32只，假手術（sham－operated，SO）組16只，門靜脈結扎聯合沙利度安（thalidomide）治療（PVL－T）組8只。

1.2門靜脈高壓腹水模型制備 參照參考文獻［3］制作門靜脈高壓模型：實驗前24h禁食，自由飲水，予5%戊巴比妥鈉溶液0.11～0.13mL/100g體質量腹腔內注射麻醉；開腹后暴露并游離門靜脈主干，沿其縱軸外置一根20G鈍性針頭，于近肝門處用3－0絲線結扎門靜脈主干及外置針頭后拔針，形成肝前性門靜脈狹窄；假手術組僅游離門靜脈主干而不結扎，其余步驟同PVL組。于術后第1、3、5、7天分別處死PVL組8只和SO組4只。為復制大鼠腹水模型，作者給每只大鼠腹腔注射33.33%葡萄糖溶液1mL，30min后收集腹水和腸系膜組織標本進行VEGF測定。

1.3檢測項目與方法

1.3.1收集腹水總量與腹水中VEGF含量測定 麻醉大鼠后開腹，收集所得腹水減去注入的葡萄糖1mL即為腹水總量。采用ELISA法測定腹水中VEGF含量，嚴格按試劑盒說明書操作（VEGF試劑盒購自美國R＆D公司）。

1.3.2門靜脈壓力測定 采用與造模相同的方法打開腹腔，穩定10min后用20G套管針穿刺腸系膜上靜脈近端，退出針芯并將套管送至門靜脈結扎遠端，將該處所測得的壓力代表門靜脈壓力；SO組因無粘連可直接穿刺門靜脈測壓，套管針另一端接壓力傳感器（型號為TSD104A），傳感器將采集到的壓力信號轉換成數字信號后輸入計算機，采用MP－2100型多道生理記錄儀測定門靜脈壓力（美國BIOPAC公司制造），單位以mm Hg表示。

1.3.3組織學檢查 處死大鼠后剪取少許腸系膜組織，經10%中性福爾馬林溶液固定后，常規石蠟包埋、切片（約4 μm），HE染色，光鏡下觀察腸系膜組織學改變。

1.3.4腸系膜組織VEGF免疫組化染色 處死大鼠后剪取少許腸系膜組織，經10%中性福爾馬林溶液固定24h后，脫水作石蠟包埋、切片（約4μm），采用免疫組化SABC法（兔抗人多克隆VEGF抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司）檢測腸系膜組織中VEGF表達情況（嚴格按試劑盒說明書操作），PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.5實時RT－PCR檢測腸系膜組織VEGF mRNA表達

1.3.5.1提取總RNA 采用Trizol裂解抽提法提取術后3d各組大鼠腸系膜組織總RNA（試劑盒購自美國Ambion公司），嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.5.2逆轉錄合成cDNA 采用ASTEC溫控系統（Pc818，日本）進行cDNA合成（cDNA逆轉錄試劑盒購自美國A＆B公司），總體積20μL，25℃、10min，37℃、120min，85℃、5s。

1.3.5.3PCR擴增 應用7500Fast實時熒光定量PCR儀（美國A＆B公司）進行擴增。擴增條件：置PCR儀95℃、20 s，以后95℃、3s，62℃、30s，共40循環，34min擴增產物片段為645bp。采用磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參照。VEGF的上、下游引物和探針分別為：5′－AGTGGTCCCAGGCTGCAC－3′，5′－TCCATGAACTTCACCACTTCGT－3′，5′－（FAM）ATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCA （TAMRA）－3′。GAPDH 的上、下游引物和探針分別為：5′－TGGGTGTGAACCACGAGAA－3′，5′－GGCATGGACTGTGGTCATGA－3′和5′－CTGCACCACCAACTGCTTAGC－3′，其中探針于5′端標記熒光發光基團FAM，3′端標記熒光淬滅基團TAMRA。通過標準曲線精確計算樣品循環閾值（Ct值）的比值（任意單位）。

1.3.6沙利度安治療門靜脈高壓腹水療效觀測 為阻斷VEGF活性，PVL－T組大鼠術后連續3d給予沙利度安（美國Sigma公司）腹腔注射（100mg/kg），術后第4天給每只大鼠腹腔注射33.33%葡萄糖溶液1mL，30min后收集腹水和腸系膜組織待檢。

1.4統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件處理，各組數據以s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PVL組與SO組大鼠門靜脈壓力變化 見表1。

表1 PVL組與SO組大鼠術后門靜脈壓力變化比較（mm Hg，s）

表1 PVL組與SO組大鼠術后門靜脈壓力變化比較（mm Hg，s）

與SO組比較，＊：P＜0.05。

組別 第1天 第3天 第5天 第7天PVL組 15.83±0.86＊16.91±0.96＊16.73±1.29＊16.39±1.62＊5.83±0.51 5.92±0.76 6.17±0.89 5.90±0.68 SO組

2.2腹水總量及腹水中VEGF含量 術后第1、3天PVL組與SO組大鼠腹水總量及腹水中VEGF含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而術后第5、7天PVL組與SO組大鼠腹水總量及腹水中VEGF含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、3。

表2 PVL組與SO組大鼠術后腹水總量比較（mL，s）

表2 PVL組與SO組大鼠術后腹水總量比較（mL，s）

與SO組比較，＊：P＜0.05，＃：P＞0.05。

組別 第1天 第3天 第5天 第7天PVL組 4.83±1.53＊ 4.92±1.53＊ 4.17±0.29＃ 3.83±0.28＃SO組3.27±0.46 3.40±0.42 3.33±0.28 3.67±0.29

表3 PVL組與SO組大鼠術后腹水VEGF含量比較（pg/mL，s）

表3 PVL組與SO組大鼠術后腹水VEGF含量比較（pg/mL，s）

與SO組比較，＊：P＜0.05，＃：P＞0.05。

組別 第1天 第3天 第5天 第7天PVL組 104.0±41.2＊ 226.1±132.2＊ 64.6±2.1＃ 62.2±22.9＃SO組42.6±4.1 62.4±16.7 60.2±17.9 45.6±10.2

2.3腸系膜組織學改變及VEGF免疫組化染色 PVL組大鼠腸系膜可見毛細血管和小靜脈明顯擴張、扭曲和變形；而SO組缺如，見插頁Ⅱ圖1。PVL組大鼠腸系膜VEGF染色呈強陽性，而SO組則呈弱陽性，兩組均在血管內皮細胞胞漿中表達，見插頁Ⅱ圖2。

圖1 PVL組與SO組腸系膜組織學改變（HE染色，×100）

圖2 PVL組與SO組VEGF免疫組化染色（×400）

2.4腸系膜組織VEGF mRNA表達 術后第3天PVL組大鼠腸系膜組織VEGF mRNA表達明顯高于SO組（分別為1.32±0.58、0.43±0.35，P＜0.05）；而 PVL－T組大鼠腸系膜組織VEGF mRNA表達明顯低于PVL組（分別為0.28±0.08、1.32±0.58，P＜0.05）。

2.5沙利度安腹腔注射后腹水改變 連續注射3d沙利度安后，PVL－T組大鼠腹水總量明顯小于PVL組［分別為（3.4±0.27）mL、（4.92±1.53）mL，P＜0.05］。

3 討 論

迄今為止，針對肝硬化患者頑固性腹水的治療仍缺乏有效措施。再者缺乏復制肝硬化腹水的有效動物模型，故作者試圖通過部分門靜脈結扎復制出大鼠門靜脈高壓模型后，再采用腹腔注射高滲葡萄糖誘導大鼠腹水形成。

本研究發現，門靜脈結扎后第1、3天腹水形成總量和腹水中VEGF含量均較SO組明顯增高（P＜0.05）；然而，門靜脈結扎后第5、7天腹水形成總量和腹水中VEGF含量與SO組比較，差異無統計學意義。并且門靜脈結扎后第3天腹水形成總量和腹水中VEGF含量達最高值，換言之，腹水VEGF含量與腹水形成總量呈正相關，提示VEGF增高后可能通過增加血管通透性促進腹水形成。

免疫組化結果表明，PVL組大鼠腸系膜VEGF染色呈強陽性，而SO組則呈弱陽性，兩組主要在血管內皮細胞胞漿中表達。由于在預實驗中，作者觀察到術后第3天大鼠腹水形成總量和腹水VEGF含量最高，故只選擇術后第3天大鼠腸系膜作VEGF mRNA分析。結果表明，術后第3天PVL組大鼠腸系膜組織VEGF mRNA表達明顯高于SO組，與Geerts等［4］研究結果一致。國外學者通過復制門靜脈高壓小鼠模型也得出了同樣結果［5－6］。業已證實，VEGF是強有力的血管生成因子，可以引起血管內皮細胞分裂增生并形成新生血管，減少細胞凋亡，促進細胞增生，對不同器官損傷均起到一定保護作用［7－8］。但研究發現VEGF促血管再生的同時亦可使血管通透性增高，導致液體滲出增加。

有資料表明，沙利度安通過降低TNF2α而下調VEGF表達，通過產生氫氧基等發揮抗血管新生作用［9－11］。本研究結果顯示，采用沙利度安腹腔注射3d后大鼠腹水形成總量與PVL組相比明顯減少；同時腸系膜組織VEGF mRNA表達亦明顯降低。作者推測沙利度安可能通過下調VEGF表達來減少腹水形成。Lopez－Talavera等［12］研究顯示沙利度安可改善門靜脈高壓大鼠高動力內臟循環狀態，并可降低門靜脈壓力。

綜上所述，門靜脈高壓可增加由于滲透性改變所致大鼠腹水形成，VEGF高表達可能與大鼠腹水形成有關，抑制VEGF的活性可能是治療肝硬化患者頑固性腹水的一種新的治療策略。

（衷心感謝日本福岡大學醫學部消化內科向坂彰太郎教授對本文的大力支持和幫助）

［1］Moore KP，Aithal GP.Guidelines on the management of ascites in cirrhosis［J］.Gut，2006，55（Suppl 6）：S1.

［2］趙永忠，王波，王天才，等.血管內皮生長因子在大鼠門脈高壓胃病中的作用初探［J］，中華消化雜志，2003，23（3）：189.

［3］Groszmann RJ，Vorobioff J，Riley E.Splanchnic hemodynamics in portal－hypertensive rats：measurement with gamma－labeled microspheres［J］.Am J Physiol，1982，242（2）：156.

［4］Geerts AM，De Vriese AS，Vanheule E，et al.Increased angiogenesis and permeability in the mesenteric microvasculature of rats with cirrhosis and portal hypertension：an in vivo study［J］.Liver Int，2006，26（7）：889.

［5］Fernandez M，Vizzutti F，Garcia－Pagan JC，et al.Anti－VEGF receptor－2monoclonal antibody prevents portalsystemic collateral vessel formation in portal hypertensive mice［J］.Gastroenterology，2004，126（3）：886.

［6］Fernandez M，Mejias M，Angermayr B，et al.Inhibition of VEGF receptor－2decreases the development of hyperdynamic splanchnic circulation and portal－systemic collateral vessels in portal hypertensive rats［J］.J Hepatol，2005，43（1）：98.

［7］董曉靈，王曙光，張玉君，等.VEGF對大鼠50%減體積肝臟移植術后肝再生的影響［J］，重慶醫學，2008，37（9）：959.

［8］郎明健，曾秋棠，陳波，等.VEGF基因轉染乳鼠心肌細胞移植治療心梗的研究［J］，重慶醫學，2005，34（11）：1669.

［9］Gupta D，Treon SP，Shima Y，et al.Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion：therapeutic applications［J］.Leukemia，2001，15：1950.

［10］Sauer H，Gunther J，Hescheler J，et al.Thalidomide inhibits angiogenesis in embryoid bodies by the generation of hydroxyl radicals［J］.Am J Pathol，2000，156（1）：151.

［11］Andr′e L M，Darid RF，Bronya S，et al.Thalidomide and at halidomide analogue inhibit endot helial cell proliferation in vit ro［J］.J Neuro Oncol，1999，43（2）：109.

［12］Lopez－Talavera JC，Cadelina G，Olchowski J，et al.Thalidomide inhibits tumor necrosis factors alpha，decreases nitric oxide synthesis，and ameliorates the hyperdynamic circulatory syndrome in portal－hypertensive rats［J］.Hepatology，1996，23：1616.