PKD3上調HEK293中uPAR的表達及機制＊

鄒志鵬，馮 麗，許萬福，鄧 凡

（南方醫科大學細胞生物學教研室，廣州510515）

蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）屬于一類新的結合二?；视停―AG）和佛波脂（PMA）的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前已鑒定出3種PKD亞型（PKD1、2、3），分別參與細胞高爾基體反面膜轉運、細胞存活、遷移、細胞分化、細胞增殖和凋亡等多種細胞功能的調節［1－2］。PKD1在低侵襲型前列腺癌細胞LNCaP中表達水平較高，不僅如此PKD1可磷酸化E－鈣粘素（E－Cadherin），從而增強LNCaP的聚集，減弱其遷移能力［3］。作者最近的研究顯示，在高侵襲型前列腺癌細胞PC－3中PKD3的表達水平明顯高于LNCaP，在LNCaP中過表達PKD3可抑制PMA誘導的細胞凋亡，并促進細胞從G1期向S期轉換；反之敲低（knockdown）PC－3中的內源性PKD3可促進細胞凋亡，也可導致 G0～1期阻滯，從而抑制 PC－3增殖［4］。而在非小細胞肺癌A549中PKD3可通過基質金屬蛋白酶－2（MMP－2）促進腫瘤的遷移（尚未發表）。提示PKD3可能通過不同的機制而促進細胞的遷移、侵襲。

尿激酶型纖溶酶原激活物受體（urokinase－type plasminogen activator receptor，uPAR）隸屬于Ly－6蛋白超家族，與其配體uPA前體結合后導致uPA的激活，從而切割纖溶酶原產生有活性的纖維蛋白溶酶，繼而降解細胞外基質，同時激活一系列 MMP－2，如 MMP－3、MMP－9及 MMP－13，在腫瘤的遷移、侵襲和轉移中起重要作用［5－6］。uPAR的表達受多種轉錄因子如AP1、HIF1－alpha及SP1調控，同時有研究表明，β－連環蛋白－TCF4信號通路可通過AP1間接上調結腸癌細胞中uPAR的表達［7］。

盡管PKD3與uPAR均可促進腫瘤的遷移，但腫瘤遷移和侵襲中PKD3及uPAR的相互調控關系尚未闡明。本研究擬以人胚腎上皮細胞系HEK293為研究模型，探求PKD3對于uPAR的調控作用及其初步機制，為闡明PKD3調控細胞遷移及腫瘤遷移和侵襲的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM液體培養基以及胎牛血清購自Hyclone，轉染試劑 Hilymax購自日本同仁化工，丙烯酰胺、SDS、CHPAS及甘氨酸等超純生化試劑均購自美國Promega公司，焦磷酸鈉、氟化鈉和釩酸鈉購自Sigma，pEGFP－C2、pEGFPPKD3及pEGFP－β－連環蛋白質粒由美國匹茲堡大學醫學院Dr.Wang Q.Jane惠贈，Rabbit Anti－PKD3Polyclonal Antibody（A300－319A）購自 Bethyl Laboratories，Mouse Anti－Beta－Catenin Monoclonal Antibody（SC－7963）購自Santa Cruz，逆轉錄和實時定量PCR試劑盒購自復能基因公司（FULGENE），實時定量PCR相關基因的引物由上海英俊公司設計和合成，其序列為 PKD3 正 向 引 物：5′－ACCCGTCCCACGATATGTCAGTA－3′，PKD3 反 向 引 物：5′－CAGCGTTTATGGCAGTTGAATTTG－3′；uPAR 正 向 引 物：5′－GGTGACGCCTTCAGCATGA－3′，uPAR 反 向 引 物：5′－CCCACTGCGGTACTGGACAT－3′；內參照基因為次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1），HRPRT1正向引物：5′－TGACACTGGCAAAACAATGCA－3′，HRPT1反向引物：5′－GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT－3′。

1.2細胞株與細胞培養 人胚腎上皮細胞系HEK293細胞由本室保存，培養于DMEM完全培養基（10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100ng/mL鏈霉素）中，培養條件為37℃、5%CO2。

1.3質粒轉染與實驗分組

1.3.1實時定量PCR HEK293細胞按2.5×105/mL密度接種于6孔板中，24h后分別轉入pEGFP－C2及pEGFPPKD3，24h后血清饑餓12h，繼以100nM PMA刺激24h，上述4組分別記為CTL、CTL＋PMA、PKD3、PKD3＋PMA組。轉染過程按照Hilymax說明書進行。

1.3.2免疫沉淀 將HEK293細胞接種于6cm培養皿中，24h后達到約50%融合密度，此時分別轉染pEGFP－C2（CTL）或pEGFP－Beta－Catenin（Beta－Catenin），24h后血清饑餓16h，以DMSO或100nM PMA刺激1h后裂解上述4組細胞準備進行免疫沉淀分析。

1.4總RNA提取及逆轉錄 總RNA提取按照TRIZOL試劑盒說明書進行。逆轉錄按照復能基因（FULGENE）逆轉錄試劑盒說明書進行。

1.5實時定量PCR檢測 按照復能基因（FULGENE）實時定量PCR試劑盒說明書進行，PCR反應：95℃預變性10min，95℃、10s，58 ℃、15s，72 ℃、20s，40個 循 環，72 ℃延伸10 min，72℃采集熒光信號。以Beta 2－微管蛋白（B2M）作為內參照基因，并采用相對定量法進行定量。相對表達量＝2－△△Ct［8］，△Ct＝目的基因平均Ct值－內參照基因平均Ct值，△△Ct＝實驗組△Ct－對照組△Ct。

1.6免疫沉淀與免疫印跡

1.6.1免疫沉淀 向每個皿中加入預冷IP裂解緩沖液（40 mM Hepes，pH 7.5，120mM NaCl，1mM EDTA，10mM 焦磷酸鈉，10mMβ－甘油磷酸鈉，50mM 氟化鈉，1.5mM 釩酸鈉，0.3%CHAPS）500μL（約1×107個/mL）冰上裂解30min，期間搖動平皿幾次以促使裂解液與細胞充分接觸。裂解后的細胞經4℃、12 000×g離心10min，取上清液標為全細胞裂解液。蛋白定量后取500μg全細胞裂解液與相應的抗體4℃孵育過夜，孵育完成后加入蛋白A/G－瓊脂糖樹脂（根據抗體屬性選擇）4℃、2h，孵育完畢后用裂解緩沖液漂洗樹脂3次，漂洗緩沖液（50mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，0.3CHAPS）漂洗2次，每管加入40μL 2×SDS上樣緩沖液100℃加熱5min，12 000×g離心5min，取上清液進行SDSPAGE或者置－70℃保存。

1.6.2免疫印跡 收集細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解30 min，于4℃、12 000×g離心20min，取上清液，用Bradford法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS－PAGE電泳并轉位到PVDF膜上，最后采用化學發光法檢測。具體步驟及試劑配方參見參考文獻［9］。

2 結 果

2.1Western blot和實時定量PCR檢測證實HEK293細胞中PKD3過表達 GFP－PKD3轉染的HEK293細胞中PKD3明顯過表達，而pEGFP－C2轉染的HEK293細胞中未見外源性PKD3表達，而且有、無PMA刺激的GFP－PKD3轉染的HEK293細胞PKD3表達一致（圖1A、1B）。

圖1 Western blot和實時定量PCR檢測結果

2.2過表達PKD3增強HEK293細胞中PMA誘導的uPAR表達 在無PMA刺激時過表達PKD3即可明顯上調HEK293細胞中uPAR轉錄水平，而PMA刺激則明顯增強（圖2）。

圖2 在HEK293中過表達PKD3可增加PMA刺激誘導的UPAR轉錄

圖3 HEK293細胞中PMA刺激誘導PKD3與β－連環蛋白相互作用。

2.3在HEK293細胞中PMA刺激誘導PKD3與β－連環蛋白結合 在HEK293中過表達PKD3可明顯增強PMA刺激誘導uPAR轉錄（圖2），而在結腸癌細胞和組織中過表達β－連環蛋白可明顯上調uPAR mRNA和蛋白水平［7］，因此作者設想PKD3直接或間接通過β－連環蛋白上調uPAR轉錄活性。如圖2所示，過表達β－連環蛋白的HEK293細胞在PMA刺激時PKD3與β－連環蛋白有明顯的共沉淀現象，提示PMA可誘導PKD3與β－連環蛋白相互作用。有趣的是，即使在未轉染GFP－β－連環蛋白CTL組中，免疫沉淀復合物中也檢測到了約130×103的條帶（NS），與GFP－β－連環蛋白相對分子質量極為接近。而在未做免疫沉淀的全細胞裂解液（Input）中，β－連環蛋白抗體同樣檢測到了此條帶，提示該條帶很可能代表一種可與PKD3及β－連環蛋白免疫復合物結合的非特異蛋白（圖3）。

3 討 論

作者前期研究證實，PKD3不僅調控前列腺癌細胞的增殖和存活［4］，還促進非小細胞癌A549的遷移和侵襲（尚未發表）。uPAR與uPA前體結合后可激活uPA的活性，激活纖維蛋白溶酶，降解細胞外基質，激活一系列基質金屬蛋白酶，從而促進包括前列腺癌在內的多種腫瘤的遷移和侵襲［5－6］。本研究表明，單純過表達PKD3即可上調HEK293中uPAR的轉錄水平，而以PMA激活PKD3活性后uPAR的轉錄水平更是明顯上調，提示PKD3很可能通過上調uPAR的表達介導細胞的遷移和侵襲。

PKD3通過什么途徑上調uPAR的表達呢？前期有研究提示，β－連環蛋白－TCF4信號通路可通過AP1間接上調結腸癌細胞和組織中uPAR的表達［7］，而近期有文獻報道，PKD1可磷酸化β－連環蛋白并使之從細胞核轉位到細胞膜并與ECadherin結合，從而促進腫瘤細胞的黏附，抑制其侵襲［10－11］。鑒于PKD1與PKD3的同源性和可能存在的功能拮抗，本研究假設PKD3可磷酸化β－連環蛋白并使之轉位到細胞核，從而間接激活uPAR的轉錄。與之相符，PMA刺激HEK293細胞可誘導PKD3與β－連環蛋白直接結合，為進一步驗證上述假設提供了有效證據。

在隨后的研究中，作者擬采用激光共聚焦顯微鏡探求在不同細胞系（HEK293及前列腺癌細胞系）中及不同條件下PKD3與β－連環蛋白之間可能存在的共定位關系，并以亞細胞組分分離（subcellular fractionation）研究 PKD3及β－連環蛋白應對各種刺激時在細胞質、細胞膜和細胞核之間的穿梭情況 ，以進一步證實PKD3與β－連環蛋白之間的相互作用，并定位其相互作用的區域。同時作者還將在不同的前列腺癌細胞系中以報告基因Topflash驗證PKD3的表達和活性是否調控TCF4的轉錄活性。

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