抑制補體對內毒素致急性肺損傷的保護作用＊

李 敏，張 程，張湘燕

（貴州省人民醫院呼吸內科，貴陽550002）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是機體在遭受嚴重感染、創傷、休克等打擊后出現的一種以肺泡毛細血管損傷導致肺水腫和微肺不張為病理特征的肺部炎癥與通透性增加綜合征，是臨床常見危重癥［1－2］。目前臨床上還缺乏治療ALI的有效手段。有研究表明，補體與ALI密切相關，補體激活產物C5a在ALI病程發展中具有啟動、放大的重要作用［3－5］。抑制補體能有效減輕肺損傷［6］。但近年來有研究表明，在脂多糖（LPS）導致的ALI中補體與病程發展無關［7］。由于LPS是ALI發病的常見誘因，而國內在這一方面幾乎沒有研究報道。因此探討補體與LPS型ALI的關系，對于相關科學問題的闡明、臨床治療策略的確定以及藥物研發都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 LPS、抗綿羊紅細胞抗體購自Sigma公司，高純度眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室孫黔云研究員贈送（其制備和活性測定方法分別參見參考文獻［8－9］），TNF－α、IL－8、ICAM－1檢測試劑盒為美國ADL公司產品，BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所，綿羊紅細胞購自貴陽醫學院實驗動物中心，Bio－Rad 550型酶標儀購自美國 Bio－Rad公司，5810R冷凍離心機購自德國eppendorf公司，Revco超低溫冰箱購自美國Thermo公司。

1.2實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠，體質量180～230g，鼠齡10周，由第三軍醫大學附屬醫院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（渝）2007－0005。將大鼠隨機分為生理鹽水對照組（對照組，n＝8）、脂多糖（lipopolysacharide，LPS）損傷組（LPS組，n＝8）、CVF干預組（CVF組，分為3個時間組，每組n＝8）。大鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉。對照組：尾靜脈注射生理鹽水，2h后采集標本。LPS組：尾靜脈注射LPS 5mg/kg，于2h后采集標本。CVF組：尾靜脈注射50 u/kg CVF去除補體，24h后尾靜脈注射5mg/kg LPS，然后分別于0.5、2、4h采集標本。

表1 各組肺濕/干質量比和PALF中PMN比、LPI變化

表2 BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度變化（pg/mL）

1.3標本收集與指標測定 大鼠麻醉后打開腹腔，從下腔靜脈抽取5mL血，室溫下靜置1h，4℃放置2h，然后4℃、2 000 r/min（離心半徑18cm）離心10min，吸取血清，分裝后置于－80℃保存，用于測定補體活性和蛋白含量。打開胸腔，切開氣管，經氣管插入12號針頭行右肺肺泡灌洗，每次2mL，共3次，總回收量約為3.6mL。計數肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中PMN百分比。BALF離心后，取上清液分裝，保存于－80℃，用于蛋白含量、TNF－α、IL－8、ICAM－1測定。計算肺通透指數（lung alveolar permeability index，LPI），即BALF蛋白/血漿蛋白。取左上肺，稱取濕重后，置于80℃烤箱中烤至恒重，稱干重，計算濕/干重比。取左下肺，經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色，進行病理學檢查。

1.4血清補體溶血活性測定 ?。?0℃凍存大鼠血清于室溫水浴快速化凍，以GGVB緩沖液1∶20稀釋，取100μL稀釋血清與100μL致敏綿羊紅細胞（5×108/mL）混勻，于37℃水浴孵育，不時輕輕振搖，30min后加入1mL冷生理鹽水中止反應，2 000r/min（離心半徑18cm）離心10min，取上清液，405nm測定OD值，計算血清補體溶血活性。

1.5統計學方法 計量資料以s表示。采用方差分析或秩和檢驗（Kruskal－Wallis法，方差不齊時用秩和檢驗）；多個樣本間兩兩比較采用q檢驗（Newman－Keuls法）或秩和檢驗（Nemenyi法）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1肺組織病理學檢查 對照組：肺組織形態基本正常，肺間質有輕度炎性細胞浸潤（插頁Ⅰ圖1A）；LPS組：肺間質水腫，可見大量炎性細胞浸潤，彌漫性出血，血管內有血栓形成（插頁Ⅰ圖1B、C）。CVF組：肺組織各種滲出明顯減少，炎性細胞滲出減少，但隨著時間進程，炎癥有加重趨勢（插頁Ⅰ圖1D、E、F）。

圖1 大鼠肺組織病理學檢查結果（HE染色）。

2.2肺濕/干質量比和PALF中PMN比、LPI變化 LPS組肺濕/干質量比、PALF中PMN比、LPI均明顯高于對照組；0.5hCVF組肺濕/干質量比、PALF中PMN比、LPI明顯低于LPS組；2hCVF組PALF中PMN比、LPI明顯低于LPS組；4hCVF組肺濕/干質量比、PALF中PMN比、LPI明顯高于0.5hCVF組（表1）。

2.3BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度變化 LPS組 BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度明顯高于對照組，各 CVF組普遍低于LPS組，但差異無統計學意義（表2）。

2.4血清補體溶血活性變化 對照組補體溶血度為（0.53±0.12 ）%（n＝5），而 LPS組血清補體溶血度只有（0.30±0.21）%（n＝8），LPS組補體明顯下降。各CVF組大鼠體內補體被耗竭，基本上檢測不出補體溶血活性（數據未列出）。

3 討 論

近年來研究發現，在ALI發病早期，補體系統首先被激活，總補體活性明顯降低，中性粒細胞聚集活性升高，引起多形核白細胞（PMN）在肺血管內聚集［10］。PMN聚集是ALI的重要發病因素。因此抑制補體激活能改善或減輕急性肺損傷的癥狀。

本實驗采用CVF去除大鼠體內補體。CVF可激活和消耗補體替代途徑成分［9］，常被用于補體相關疾病研究動物模型中去除補體。在本實驗中所采用的CVF劑量可使大鼠在實驗期間處于完全的補體消除狀態［8］。

本研究表明，在注射LPS后大鼠血清補體活性顯著下降，大鼠出現較典型的ALI癥狀，提示在LPS所致急性肺損傷的發病過程中有補體的激活和消耗。而預先用CVF去除補體后大鼠BALF中蛋白和細胞滲出減少，肺水腫程度和病理改變減輕，說明抑制補體確實可減輕LPS所致ALI的癥狀。但BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度沒有明顯降低。在本實驗中可以看到，抑制補體在ALI早期可以明顯減輕炎性細胞浸潤，但隨著時間進程，炎性細胞浸潤程度加重，提示在LPS導致的ALI中，早期的炎性細胞浸潤與補體有密切關系，而其后的炎性細胞浸潤程度加重則可能與核因子－κB的激活調控有關［11］。Rittirsch等［7］2008年曾報道在LPS導致的ALI中，補體與病程發展無關。而本實驗結果則明確表明，補體參與了LPS所致ALI的早期病程發展。該文獻采用氣管內給予LPS造模，而作者采用尾靜脈注射LPS造模。實驗結論的不同很可能是這兩種不同的造模途徑在體內引起的LPS清除反應有差異所致。而靜脈注射LPS造模無疑與臨床情況更為接近。LPS造模在本實驗中還觀察到對照組在注射生理鹽水后肺組織有輕度的炎性細胞浸潤，近年來也有文獻報道了這一現象［12］。

本研究表明，在內毒素（LPS）引起的ALI發病早期采用抗補體治療策略能有效減輕早期病理癥狀，對ALI的治療具有積極的意義和價值，但對ALI總體病程的影響尚需系統深入的研究與評價。

［1］Ware LB，Matthay MA.The acute respiratory distress syndrome［J］.N Engl J Med，2000，342（18）：1334.

［2］Brower RG，Ware LB，Berthiaume Y，et al.Treatment of ARDS［J］.Chest，2001，120（4）：1347.

［3］Hammerschmidt DE，Weaver LJ，Hudson LD，et al.Association of complement activation and elevated plasma－C5a with adult respiratory distress syndrome.Pathophysiological relevance and possible prognostic value［J］.Lancet，1980，1（8175）：947.

［4］Solomkin JS，Cotta LA，Satoh PS，et al.Complement activation and clearance in acute illness and injury：evidence for C5aas a cell－directed mediator of the adult respiratory distress syndrome in man［J］.Surgery，1985，97（6）：668.

［5］Mulligan MS，Schmid E，Beck－Schimmer B，et al.Requirement and role of C5ain acute lung inflammatory injury in rats［J］.J Clin Invest，1996，98（2）：503.

［6］Proctor LM，Strachan AJ，Woodruff TM，et al.Complement inhibitors selectively attenuate injury following administration of cobra venom factor to rats［J］.Int Immunopharmacol，2006，6（8）：1224.

［7］Rittirsch D，Flierl MA，Day DE，et al.Acute lung injury induced by lipopolysaccharide is independent of complement activation［J］.J Immunol，2008，180（11）：7664.

［8］Sun QY，Chen G，Guo H，et al.Prolonged cardiac xenograft survival in guinea pig－to－rat model by a highly active cobra venom factor［J］.Toxicon，2003，42（3）：257.

［9］Vogel CW，Muller－Eberhard HJ.Cobra venom factor：improved method for purification and biochemical characterization［J］.J Immunol Methods，1984，73（1）：203.

［10］朱元玨，陳文彬.呼吸病學［M］.北京：人民衛生出版社，2003：1396.

［11］羅真春，黃燕，秦開秀，等.核因子－κB在急性肺損傷小鼠中的動態表達［J］.重慶醫學，2009，38（16）：2005.

［12］林琴，王廣發，湯秀英，等.地塞米松對內毒素致急性肺損傷大鼠肺的保護作用［J］.北京大學學報：醫學版，2006，38（4）：393.