過氧化物酶體增殖物激活受體γ在大鼠氣道黏液高分泌中的表達及意義＊

張湘燕，劉維佳，姚紅梅，馮端興，張 程

（貴州省人民醫院呼吸內科，貴陽550002）

呼吸道過度分泌黏液和黏液成分改變所致的黏稠度增加可引起氣流阻塞和呼吸道反復感染。近年來研究證明，氣道黏液高分泌增加了慢性氣道疾病的住院率及病死率，是影響病情和預后的獨立危險因素［1］。由于目前尚無治療氣道黏液高分泌特異有效的藥物，因此進一步闡明氣道黏液高分泌的發生機制，將有助于干預氣道黏液調控的重要環節，有效控制氣道黏液高分泌。本研究以大鼠為研究對象，探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ）在內毒素誘導氣道黏液高分泌中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 內毒素E.coli 055∶B5（美國Sigma公司）、黏蛋白5AC（MUC5AC）單克隆抗體（美國Neomarkers公司）、PPAR－γ多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、免疫組化染色SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）、Taq DNA聚合酶及dNTP（美國Promega公司）等。

1.2 動物模型制備及分組 健康清潔級雄性SD大鼠12只，體質量200～220g，鼠齡10～12周，隨機分為對照組和內毒素組。對照組以1%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔注射，麻醉生效后切開頸部皮膚，暴露氣管，向氣管內注入生理鹽水100μL，隨后將大鼠直立，并輕輕晃動1～2min。內毒素組操作方法同前，參考Yanagihara等［2］的方法，氣管內注入濃度為2g／L的LPS 100μL。

1.3 標本收集 氣管注藥后第4天，腹腔注射1%戊巴比妥鈉50mg／kg麻醉大鼠，取其右中肺置于4%甲醛中固定，剪取靠近中心氣道的其余右肺組織置液氮中保存備用。

1.4 氣道上皮杯狀細胞計數及黏液物質測定 采用HE及阿辛藍－過碘酸雪夫（AB－PAS）染色進行杯狀細胞計數及檢測氣道黏液物質表達。于光鏡（×200）下采集5個完整的支氣管橫斷面圖像，計算杯狀細胞占所有上皮細胞的比例，并采用積分法進行半定量分析，杯狀細胞占上皮細胞比例：＜5%為0分；≥5～25%為1分；＞25～50%為2分；＞50～75%為3分，＞75%為4分。應用IMAGE－Pro plus4.5圖像分析系統以相對著色面積表示氣道黏液物質的表達。

1.5 氣道及肺組織MUC5AC、PPAR－γ蛋白測定 用免疫組化鏈菌素過氧化物酶連接（SP）法檢測氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ表達。用PBS代替一抗作陰性對照。陽性細胞呈棕黃色。高倍鏡下觀察MUC5AC為胞漿顯色，PPARγ為胞核顯色。應用IMAGE－Pro plus4.5進行圖像分析，以平均積分光密度為指標對免疫組化染色進行定量分析。

1.6 檢測氣道及肺組織 MUC5AC、PPARγmRNA表達 采用實時定量PCR（real－time PCR）檢測 MUC5AC、PPARγmRNA表達。取靠近中心氣道及右肺組織，用Trizol常規一步法提取氣道及肺組織總RNA。按cDNA合成試劑盒說明配置反應體系，在PCR儀中進行反應，逆轉錄合成第1條cDNA，以此為模板分別加入 MUC5AC、PPARγ、甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）引物及熒光染料在實時定量PCR儀上進行擴增，94℃預變性2min，94℃變性20s，50℃復性30s，72℃延伸40s，共40次，72℃再延伸5min。MUC5AC引物序列：上游引物5′－TCC TTC TTG TCA ATG GTG TCT－3′，下游引物5′－ACC AGG TTC AGG ACA AGT AG－3′，擴增長度為151 bp。PPAR－γ引物序列：上游引物5′－GTC TCA CAA TGC CAT CAG GTT－3′，下游引物5′－TTC AGC TGG TCG ATA TCA CT－3′，擴增長度為90bp。GAPDH引物序列：上游引物5′－CCT CAA GAT TGT CAG CAA T－3′，下游引物5′－CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT－3′，擴增長度為141bp。上述引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。將實時定量PCR儀檢測熒光強度的時相統一設定在擴增反應退火期，采用50℃、30s作為退火期。測定各樣品循環閾值（Ct值），并與標準曲線進行比較，計算目的基因相對于管家基因的定量。

1.7 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件進行統計學分析。數據以±s表示，多組間均數比較采用方差分析，均數兩兩比較采用q檢驗。相關性分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 氣道上皮杯狀細胞及黏液物質的變化 與對照組比較，內毒素組氣道上皮杯狀細胞積分及氣道黏液物質的表達明顯增加（表1）。

表1 兩組大鼠氣道上皮杯狀細胞積分及黏液物質變化（±s，n＝6）

表1 兩組大鼠氣道上皮杯狀細胞積分及黏液物質變化（±s，n＝6）

＊：與對照組比較，P＜0.01。

組別 杯狀細胞積分（分） AB－PAS染色陽性相對著色面積（%）對照組0.50±0.11 4.18±0.70內毒素組 2.73±0.33＊ 56.49±9.57＊

2.2 氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表達MUC5AC陽性染色顆粒主要見于支氣管黏膜上皮，部分見于黏膜下腺體（插頁Ⅰ圖1、2）。與對照組比較，內毒素組氣道及肺組織MUC5AC蛋白及mRNA表達明顯增加。PPARγ陽性染色顆粒主要見于氣道上皮細胞、氣道及肺泡周圍浸潤的炎癥細胞。與對照組比較，內毒素組氣道及肺組織PPAR－γ蛋白及mRNA表達增加（表2）。

2.3 相關性分析 內毒素組氣道及肺組織PPARγ蛋白表達水平與氣道及肺組織MUC5AC mRNA表達水平呈負相關（r＝－0.829，P＜0.05）。

表2 兩組大鼠氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表達（±s，n＝6）

表2 兩組大鼠氣道及肺組織MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表達（±s，n＝6）

＊：與對照組比較，P＜0.05。

組別MUC5AC平均積分光密度 相對拷貝數PPARγ平均積分光密度 相對拷貝數對照組 1785.00±236.05 2.42±0.68 825.84±107.02 2.23±0.53內毒素組 3998.95±513.13＊ 39.03±9.43＊ 1121.08±202.53＊ 6.00±1.44＊

3 討 論

氣道黏液主要由氣道上皮杯狀細胞、黏膜下腺體分泌，適量黏液分泌對保持黏膜濕潤、防御病原微生物和有害物質的侵入及維持黏液纖毛清除功能具有重要作用。黏蛋白（mucin，MUC）質和量的變化對黏液的黏彈性起主要作用，其中由杯狀細胞產生的MUC5AC不管是在健康個體還是氣道疾病患者都是氣道分泌黏液中最主要的黏蛋白成分［3］。MUC過度表達、氣道上皮杯狀細胞、黏液分泌細胞增生與化生以及貯存的黏蛋白分泌增多是氣道黏液高分泌發生的主要病理機制。許多因素，如空氣污染物、細菌成分、細胞因子、炎癥介質等都可增加氣道上皮細胞MUC表達，導致氣道黏液高分泌。由于細菌感染是慢性氣道疾病發生、發展和反復加重的重要因素，尤其革蘭陰性菌是最主要的致病菌之一，因此感染對MUC表達信號通路的調控倍受關注。

PPARγ于1990年由Issemann和Green［4］首先從小鼠肝臟克隆出來，是一類由致密分子構成依賴配體激活的核轉錄因子，主要功能是與配體結合后通過對靶基因轉錄的調節引起蛋白合成和使生物學效應發生改變。早期研究認為，PPARγ的功能僅限于調控脂肪細胞分化、脂質和糖代謝。近年來研究發現，PPARγ除具有調節脂肪代謝、糖代謝、細胞分化凋亡等生物學效應外，還可能參與炎癥控制并具有免疫調節作用［5］。對呼吸系統的研究發現，氣道上皮、支氣管黏膜下層和氣道平滑肌均有 PPARγ表達，可能與慢性氣道炎癥有關［6－7］。Birrel等［8］對大鼠預先給予PPARγ激動劑——羅格列酮處理，能明顯減少內毒素（LPS）刺激引起的氣道中性粒細胞聚集和多種細胞因子的釋放。在哮喘的動物模型中，霧化吸入羅格列酮后可使IL－2、IL－4和IFN－γ等細胞因子產生減少，肺部炎癥減輕，黏液分泌減少［9］。本研究結果顯示，在正常大鼠氣道及肺組織有少量PPARγ蛋白及mRNA表達，氣管內注射LPS后氣道上皮杯狀細胞、氣道黏液物質、氣道及肺組織MUC5AC蛋白及mRNA表達明顯增加，機體出現氣道黏液高分泌改變，同時氣道PPARγ蛋白及mRNA表達亦有所增加。表明LPS作為革蘭陰性細菌細胞壁外膜的主要結構成分，侵入機體后可刺激氣道上皮杯狀細胞數目增多，上調氣道上皮細胞MUC基因MUC5AC的表達，促進MUC的合成，而PPARγ參與了細菌誘導氣道黏液高分泌的發生。進一步的相關性分析顯示，氣道及肺組織PPARγ蛋白表達水平與氣道及肺組織MUC5AC mRNA表達呈負相關，提示PPARγ對LPS誘導的氣道黏液高分泌可能存在負性調控作用，但具體的調控機制是否與PPARγ的抗炎作用有關尚待深入研究。

［1］ Groneberg DA，Wagner U，Chung KF.Mucus and fatal asthma［J］.Am J Med，2004，116（1）：66.

［2］ Yanagihara K，Seki M，Cheng PW.Lipopolysaccharide induces mucus cell metaplasia in mouse lung［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24（1）：66.

［3］ Young HW，Williams OW，Chandra D，et al.Central role of MUC5AC expression in mucous metaplasia and its regulation by conserved 5′elements［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2007，37（3）：273.

［4］Issemann I，Green S.Activation of a number of the steroid hormone receptor surperfamily by peroxisome proliferators［J］.Nature，1990，347：645.

［5］ Lee KS，Park SJ，Kim SR，et al.Modulation of airway remodeling and airway inflammation by peroxisome proliferator－activated receptor gamma in a murine model of toluene diisocyanate－induced asthma［J］.J Immunol，2006，177（8）：5248.

［6］ Wang AC，Dai X，Luu B，et al.Peroxisome proliferators－activated receptor－gamma regulates airway epithelial cell activation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24：688.

［7］ Ward JE，Tan X.Peroxisome proliferator activated receptor ligands as regulators of airway inflammation and remodelling in chronic lung disease［J］.PPAR Res，2007，2007：14983.

［8］ Birrel MA，Patel HJ，Mccluskie K，et al.PPAR－gamma agonists as therapy for diseases involving airway neutrophilia［J］.Eur Respir J，2004，24：18.

［9］ Honda K，Marquillies P，Capron M，et al.Peroxisome proliferator－activated receptor gamma is expressed in airways and inhibits features of airway remodeling in a mouse asthma model［J］.J Allergy Clin Immunol，2004，113：882.