傳染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆蟲細胞中的表達與應用

歐陽偉，王永山，周宇，張海彬，唐雨德

1 江蘇省農業科學院獸醫研究所 農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014

2 南京農業大學動物醫學院，南京 210095

3 南京軍區軍事醫學研究所，南京 210002

動物及獸醫生物技術

傳染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆蟲細胞中的表達與應用

歐陽偉1,2，王永山1，周宇1,2，張海彬2，唐雨德3

1 江蘇省農業科學院獸醫研究所 農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014

2 南京農業大學動物醫學院，南京 210095

3 南京軍區軍事醫學研究所，南京 210002

將近期引起傳染性法氏囊病 (IBD) 免疫預防失敗的傳染性法氏囊病病毒 (IBDV)vp2基因，定向克隆入桿狀病毒表達系統的供體質粒pFastBacHTA中，構建重組供體質粒pFastBacHTA-VP2，轉化Escherichia coliDH10Bac感受態，篩選重組桿狀病毒表達質粒pBac-VP2。用pBac-VP2轉染Sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒vBac-VP2。對重組桿狀病毒vBac-VP2感染的Sf9細胞，用間接免疫熒光試驗 (IFA) 檢測，具有特異性熒光；用IBDV抗體夾心ELISA檢測，呈陽性反應，抗原效價達到1.6×103；用Western blotting分析，在53 kDa處出現一條特異蛋白條帶；電鏡觀察，重組Vp2蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒，在感染細胞中發現了“包涵體樣”結構。用HisTrap HP親和層析柱純化的重組Vp2蛋白作為包被抗原，建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法具有良好的特異性。用重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細胞裂解物，免疫2周齡SPF雞，一次免疫14 d后，ELISA檢測抗體效價為8×102，中和抗體效價為1106，攻毒實驗的存活率為30%；二次免疫14 d后，ELISA抗體效價為3.2×103，中和抗體效價為2536，存活率為100%。在實驗觀察7 d內，重組Vp2蛋白免疫保護雞未顯任何臨床癥狀和病理變化，法氏囊/體重比高于對照組 (P＜0.05)。本實驗制備的病毒樣顆粒重組Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和檢測試劑方面顯示出了應用前景。

傳染性法氏囊病病毒，vp2基因，病毒樣顆粒，包涵體樣結構，間接ELISA，免疫實驗

Abstract:Protective immune response of the available IBD vaccine is insufficient to fully protect against the prevailing strain of the infectious bursal disease virus (IBDV). Such a vaccination escape IBDV field isolate idenfied from Anhui province of China inDecember 2007, where IBD broke out at 2 weeks post vaccination. The IBDVvp2gene was cloned into pFastBacHTA donor plasmid, followed by generation of the recombinant bacmid DNA pBac-VP2. The latter was used to transfect insect cell Sf9 with Lipofectamine to produce recombinant baculovirus vBac-VP2. The Sf9 cells infected with vBac-VP2 were stained positive against IBDV antibody using the indirect immunofluorescence assay (IFA), which was also confirmed by the detection of IBDV Vp2 protein in the infected Sf9 cells by IBDV sandwich ELISA. Western blotting revealed that the calculated protein of approximately 53 kDa was in the expressed in the insect cells. Moreover, virus-like particles (VLPs) and “inclusion body-like”structure in the infected Sf9 cells were observed under electron microscopy. We further developed an indirect ELISA for the detection of the IBDV antibodies,which was specific and sensitive. In addition, the lysates of vBac-VP2 infected cells was used to immunize 2-week-old SPF chickens,followed by challenging with the virulent IBDV, the survival rate was 30% at 14 days post primary immunization, however, the survival rate was 100% at 14 d after the booster vaccination. The ELISA antibody titers was up to 3.2×103and neutralization antibody titer was 2536, significantly higher than those of one-shot vaccination, 8×102and 1106, respectively. The immunized chickens did not show any clinical signs and histopathological changes of infection in 7-days trial time. The bursa/body-weight ratios were higher than those of the unimmunized control (P< 0.05). The virus-like-particle recombinant Vp2 protein expressed in insect cells promises to be a novel subunit vaccine and diagnostic reagent candidate for IBDV.

Keywords:infectious bursal disease virus,vp2gene, virus-like particles (VLPs), inclusion body-like structure, indirect ELISA,protection test

傳染性法氏囊病 (Infectious bursal disease，IBD) 是引起我國及世界養禽業經濟損失嚴重的主要傳染病之一。接種疫苗是預防該病最有效的方法，在上世紀80年代的中后期，在世界范圍內爆發了在抗原性和致病性等方面與經典毒株有很大差異的IBDV變異毒株，使養雞業遭受重創[1-5]。變異株和超強毒株 (vvIBDV) 的出現使該病的防控難度加大，IBD免疫預防失敗已成為禽病防控中的重要問題[4,6-8]。目前，使用的常規弱毒疫苗和滅活疫苗，其安全性和制造工藝仍存在不足：為預防變異毒株而采用中強毒力活疫苗存在著較大的生物安全問題，因為在不同 IBDV毒株之間潛在著基因重配的可能，給該病的防控帶來隱患；滅活疫苗存在著抗原制備的困難；因此，在當前IBD防控實際工作中，亟需免疫效力強、生物安全性高、并且針對當前流行毒株的新型 IBD基因工程疫苗的問世。IBDV屬雙RNA 病毒科雙RNA病毒屬，基因組包括大 (A)小 (B) 2個片段，有5種病毒蛋白：Vp1、Vp2、Vp3、Vp4和Vp5。Vp2占病毒蛋白的51%，既是IBDV的主要結構蛋白，又是病毒的主要保護性抗原，與病毒中和抗體的誘導、抗原和毒力的變異以及細胞凋亡的誘導等有關[1-2,9-10]。Vp2的高變區是病毒中和性單抗的結合必需區，該區的點突變是 IBDV抗原漂移、毒力變異進而造成經典疫苗株免疫失敗的主要原因。迄今，IBD基因工程疫苗研究均以vp2為靶基因，采用的表達系統包括：大腸桿菌[11]、酵母[12]、雞痘病毒載體[13]、桿狀病毒表達載體[14]、核酸疫苗[15]以及近期報道的多表位疫苗[16]等。目前IBD基因工程疫苗研究中的主要問題：或者是重組IBDV蛋白的表達量不夠高，或者是重組IBDV蛋白復性難度大，或者是源于一種毒株的重組蛋白不適用于其他變異毒株。因此，在vp2基因選擇、表達系統以及表達策略方面進一步探索新的技術路線是十分必要的。近期，筆者對安徽省在2007年12月發生的兩起免疫失敗的IBDV野外毒株的vp2基因的分子特征進行了分析，其vp2基因與當時預防使用的疫苗毒株 (B87株) 的vp2基因序列有較大差異[17]，再次佐證了IBDV變異株的危害。鑒于此，本實驗針對 IBD基因工程疫苗研究中的主要問題，選用該vp2基因，運用桿狀病毒表達系統將其在昆蟲細胞中表達，制備病毒樣顆粒重組 Vp2蛋白，研制新型高效IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙绾蜋z測試劑。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種與細胞

含有vp2基因的克隆質粒pUC-VP2 (AH1) 系本實驗室用RT-PCR方法從2007年12月在安徽境內發生的IBD免疫預防失敗的病雞法氏囊組織中擴增的vp2基因構建[17]。含有 6×His標簽的供體質粒pFastBacHTA、含有Bacmid和Helper plasmid的E.coliDH10Bac、Sf9昆蟲細胞、E. coliTOP10均購自Invitrogen公司。IBDV 疫苗毒株B87雞胚成纖維細胞 (CEF) 適應毒和9～10日齡SPF雞胚均由南京天邦生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑

雞抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗 (B87)多次免疫SPF雞獲得，用DEAE纖維素 (DE32) 純化；兔抗雞IgG抗體和HRP標記的兔抗雞IgG抗體由本實驗室制備。MiniBEST質粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、IPTG均購自TaKaRa公司；BAC/PAC DNA Isolation Kit購自 Omega公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自 Invitrogen公司；胎牛血清、Grace’s昆蟲細胞培養基購自Gibco公司。FITC標記的羊抗兔IgG抗體、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 引物的設計與合成

根據vp2基因序列和供體質粒pFastBacHTA表達閱讀框設計vp2基因擴增引物：

重組桿狀病毒表達質粒鑒定引物：

以上引物由Invitrogen公司合成。

1.4Vp2基因重組供體質粒的構建

將克隆質粒 pUC-VP2 (AH1) 和供體質粒pFastBacHTA分別用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收vp2和載體DNA片段，DNA膠回收試劑盒純化，T4 DNA 連接酶連接，轉化E. coliTOP10感受態細菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上 (含氨芐青霉素100 mg/L)，37℃培養 14 h。挑單菌落接種入 LB (含氨芐青霉素100 mg/L)，振搖培養12 h，用MiniBEST 質粒純化試劑盒提取質粒，EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，獲得含vp2基因的重組供體質粒pFastBacHTA-VP2。

1.5Vp2基因重組桿狀病毒表達質粒的構建

用重組供體質粒pFastBacHTA-VP2轉化E. coliDH10Bac感受態細胞 (含 Bacmid DNA和 Helper plasmid)，在LB培養基中37℃，220 r/min，4 h，用LB 做一系列稀釋 (10?1、10?2、10?3)，涂布于 LB 配制的1.5%瓊脂平皿上 (含有50 mg/L卡那霉素、7 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環素以及 100 mg/L X-gal和40 mg/L IPTG)，37℃培養16 h，挑白色單菌落，接種于含有3種抗生素 (50 mg/L卡那霉素、7 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環素) 的LB中，37℃振搖培養16 h，用BAC/PAC DNA Isolation Kit提取重組Bacmid DNA，用vp2基因正向引物vp2F(36) 和M13/pUC通用下游引物 PCR鑒定重組 Bacmid DNA，獲得含vp2基因的重組桿狀病毒表達質粒pBac-VP2。

1.6Vp2基因重組桿狀病毒的獲得

在轉染前1天，用對數生長期的Sf9昆蟲細胞在 6孔細胞培養板中制備單層細胞。轉染時，棄去舊培養基，并用無血清無抗生素的Grace’s液洗滌細胞，然后用孵育好的 pBac-VP2-Lipofectamine2000混合物平鋪Sf9細胞單層，27℃培養5 h，棄去pBac-VP2-Lipofectamine2000混合物，每孔加入含10%血清及抗生素的 Grace’s完全培養液，置 27℃繼續培養；實驗同步設立用未插入外源基因片段的Bacmid質粒和單用轉染試劑轉染 Sf9細胞為對照；每日觀察，直到細胞病變達90%時，收集細胞及上清液，在Sf9昆蟲細胞上繼續傳代2次，獲得第3代重組桿狀病毒 (P3代)，進行鑒定。

1.7Vp2基因重組桿狀病毒的鑒定

1.7.1IFA檢測

實驗在24孔細胞培養板中進行。將重組桿狀病毒 (P3代) 接種到Sf9細胞，培養72 h后，吸棄細胞培養液，用無血清的培養液洗 2次，然后向細胞培養孔中加入?20℃預冷的無水乙醇1 mL/孔，4℃固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入40倍稀釋的雞抗IBDV高免血清，200 μL/孔，37℃孵育2 h，PBS洗滌5次，拍干；加入100倍稀釋的兔抗雞IgG抗體，200 μL/孔，37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，拍干；加入50倍稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG抗體工作液，200 μL/孔，37℃孵育 1 h，PBS洗滌 5次，置于熒光顯微鏡下觀察。同步設立無vp2基因的桿狀病毒 (Baculovirus) 感染 Sf9細胞和正常細胞為對照。

1.7.2夾心ELISA檢測

用包被液稀釋雞抗IBDV IgG至5 mg/L，然后包被酶標板，100 μL/孔，4℃過夜，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；用封閉液 (含10% FBS的PBST)滿孔封閉，37℃，2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；加入超聲破碎好的P4代細胞，100 μL/孔，37℃，2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；加入1∶1 000稀釋的 HRP標記的雞抗 IBDV IgG，100 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；顯色。實驗同步設立陰性和空白對照。

1.7.3Western blotting分析

將P3代vBac-VP2感染的Sf9細胞、Bacmid轉染產生的野生桿狀病毒感染的Sf9細胞和正常的Sf9細胞用0.01 mol/L PBS (pH 7.2) 離心洗滌2次后，按原體積1%加入PBS重懸，3次凍融后，加入5×SDSLoading Buffer，按常規方法進行12%分離膠和5%濃縮膠的SDS-PAGE電泳分析，轉印到硝酸纖維素膜上，轉印完畢后，將硝酸纖維素膜用 5%脫脂奶粉 4℃封閉過夜，然后用一抗 (雞的 IBDV高免血清)、二抗 (HRP標記的兔抗雞IgG抗體) 分別與之作用，DAB底物顯色，觀察特異蛋白條帶。

1.7.4電鏡觀察

用P3代vBac-VP2感染Sf9昆蟲細胞，待細胞完全病變之后，收集細胞，凍融3次，3 000 r/min離心30 min，取上清使用電鏡負染技術制片觀察。用同樣方法收集病變細胞，不凍融，3 000 r/min離心30 min沉淀細胞，2%戊二醛固定液固定，超薄切片，電鏡觀察，同時設立正常Sf9昆蟲細胞作空白對照。

1.8 重組Vp2蛋白的純化

取300 mL vBac-VP2感染的細胞培養物，離心收集細胞，用12 mL結合緩沖液重懸，并加入20 μL 100 mmol/L PMSF，冰浴條件下超聲破碎至細胞懸液清亮，4℃、10 000 r/min離心30 min去除細胞碎片，取上清用0.45 μm孔徑濾膜過濾，然后按照HisTrap HP說明書純化重組Vp2蛋白。

1.9 重組Vp2蛋白的應用

1.9.1IBDV抗體間接ELISA檢測方法的建立

用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將純化的重組Vp2蛋白稀釋至5 mg/L，包被ELISA板，100 μL/孔，4℃過夜；用PBST洗滌3次，每次2 min，拍干；每孔加入封閉液 (含 10% FBS 的 PBST) 300 μL，37℃，2 h；用PBST洗滌3次，每次2 min，拍干；加入待檢血清樣品，37℃，1 h；用PBST洗滌3次，每次2 min，拍干；加入HRP-標記的兔抗雞IgG (1∶2 000)100 μL，37℃，1 h；用 PBST洗滌 3次，每次 2 min，拍干；加入顯色劑A液 (四甲基聯苯胺溶液)、B液(過氧化氫脲溶液) 液各 1滴，暗盒顯色；2 mol/L H2SO4終止，測A450值，判定結果。

1.9.2重組Vp2蛋白的免疫攻毒試驗

將100只2周齡SPF雞 (購自南京天邦生物科技有限公司) 隨機分成 3組，隔離飼養：重組 Vp2蛋白加免疫佐劑組 60只，將重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細胞培養物 (ELISA效價為1 600) 與等體積的免疫佐劑 (法國 SEPPIC公司 Montainde ISA 206 VG) 混合乳化，經胸部肌肉注射，0.4 mL/只/次，第1次免疫14 d后進行第2次免疫；單用免疫佐劑組20只，免疫程序與前者相同，只注射免疫佐劑，0.4 mL/只/次；空白對照組20只，不注射，只是與其他 2個實驗組在同樣條件下飼養。全部的實驗雞均在免疫實驗時經翅靜脈采血，并在免疫后每間隔7 d采血1次，分別測定抗體效價。

將采集的實驗雞血清從1∶100開始進行2倍比連續稀釋，用IBDV抗體間接ELISA檢測方法 (見1.9.1) 測定抗體效價。

將實驗雞血清從1∶100開始進行10倍比連續稀釋，各取100 μL，分別與等體積的IBDV B87細胞適應毒稀釋物 (病毒含量200 TCID50/0.1 mL) 混合，置37℃反應1 h，接種于含有CEF單層的96孔培養板中，100 μL/孔 (病毒含量 100 TCID50/孔)，每份待檢血清設4個重復；同時設立病毒對照、陽性血清對照、陰性血清對照、細胞對照。置37℃、5%CO2培養，每天觀察病變，記錄結果，按Reed-Muench法計算出每個血清樣品的病毒中和抗體效價，計算幾何均數 (GMT)，為該血清的病毒中和抗體效價。

第1次免疫14 d后，從3個實驗組中各取半數雞 (重組Vp2蛋白加免疫佐劑組30只、單用免疫佐劑組10只、空白對照組10只)，同時采用點眼、滴鼻、擦肛3種途徑人工感染IBDV強毒[16]，0.2 mL/只(病毒含量100 LD50)，攻毒后每日觀察試驗雞的生長和發病情況，連續觀察7 d，記錄死亡數，及時解剖檢查病死雞法氏囊組織病變并取少許置于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察組織學變化。第7天捕殺存活雞，稱體重，檢查法氏囊病理變化并稱重；按以下公式分別計算各組試驗雞的法氏囊/體重比 (BB比值)，并進行統計學分析 (F檢驗)。對3個實驗組的另半數雞進行第2次免疫，14 d后同法攻毒。

法氏囊/體重比(BB比值) = 法氏囊重(g) ×1 000/試驗雞體重(g)

2 結果與分析

2.1Vp2基因重組供體質粒的鑒定

將構建的供體質粒 pFastBacHTA-VP2用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳可見兩條帶，分別約為1.4 kb與5.0 kb，與預期大小相符 (圖1)。

2.2Vp2基因重組桿狀病毒表達質粒的鑒定

用重組供體質粒pFastBacHTA-VP2轉化E. coliDH10Bac感受態細胞，藍白斑與三抗篩選，挑白色菌落克隆，用BAC/PAC DNA Isolation Kit提取重組Bacmind DNA，重組Bacmid DNA經PCR鑒定 (引物為vp2基因正向引物vp2F(36) 和M13/pUC通用下游引物)，1%瓊脂糖凝膠電泳可見一條大小約為2 100 bp的條帶，與理論值2 092 bp相符，說明vp2基因已成功轉座入Bacmid DNA中 (圖2)。

圖1 pFastBacHTA-VP2的酶切圖譜Fig.1 Digestion map of pFastBacHTA-VP2. M: DNA marker;1, 2: pFastBacHTA-VP2 digested byEcoRⅠ andHind Ⅲ.

圖2 pBac-VP2的PCR分析圖譜Fig.2 PCR analysis of pBac-VP2. M: DNA marker; 1, 2:plasmid pBac-VP2.

2.3Vp2基因重組桿狀病毒的獲得

將鑒定好的pBac-VP2按Lipofectamine2000使用說明書轉染Sf9細胞，每天觀察病變，5 d后，轉染孔可見部分細胞變圓變大，第 6天細胞病變達90%以上，收集病變細胞及上清，1 500 r/min離心10 min，上清液即為含vp2基因的重組桿狀病毒vBac-VP2原液 (P1代)，繼續傳代2次，獲得高效價的重組桿狀病毒vBac-VP2 (P3代)。

2.4Vp2基因重組桿狀病毒的鑒定

2.4.1IFA檢測

在熒光顯微鏡下，可以看見感染P3代vBac-VP2病毒的 Sf9昆蟲細胞呈現較強的熒光，而感染野生型桿狀病毒的細胞與正常的細胞則無熒光 (圖 3)。表明vp2基因在昆蟲細胞中表達。

2.4.2夾心ELISA檢測

用夾心ELISA檢測P4代vBac-VP2病毒細胞超聲裂解物，加入P4代樣品的孔，顯示陽性，抗原效價達到 1.6×103，表明vp2基因在昆蟲細胞中得到了高效表達。正常昆蟲細胞和PBST對照孔則均為陰性。

2.4.3Western blotting分析

對 P3代 vBac-VP2病毒細胞培養物進行 SDSPAGE，用Western blotting分析，在53 kDa附近可見一條特異蛋白帶，表明重組 Vp2蛋白具有 IBDV抗原反應性 (圖4)。

2.4.4電鏡觀察

用電鏡負染技術觀察，在P3代vBac-VP2病毒感染的昆蟲細胞中可發現病毒樣顆粒，直徑約60 nm(圖 5A)；用 vBac-VP2病毒感染的病變細胞制備超薄切片，可發現由病毒樣顆粒在細胞中形成的“包涵體樣”結構 (圖5B)。

圖3 感染vBac-VP2的Sf9昆蟲細胞IFA檢測結果 (100×)Fig.3 Detection of Sf9 cells infected with vBac-VP2 by IFA (100×). (A) Normal Sf9 cells. (B) Sf9 cells infected with Baculovirus.(C) Sf9 cells infected with vBac-VP2.

圖4 感染vBac-VP2的Sf9細胞SDS-PAGE和Western blotting分析結果Fig.4 Analysis of vBac-VP2 infected Sf9 cells by SDS-PAGE and Western blotting. M: protein marker; 1: normal Sf9 cells (in SDS-PAGE); 2: Sf9 cells infected with vBac-VP2(in SDS-PAGE); 3: Sf9 cells infected with vBac-VP2 after ultrasonication (in SDS-PAGE); 4: purified Vp2 protein expressed in Sf9 cells(in SDS-PAGE); 5: normal Sf9 cells(in Western blotting); 6: Sf9 cells infected with vBac-VP2(in Western blotting).

圖5 感染vBac-VP2的Sf9細胞電鏡檢查結果Fig.5 Observation of Sf9 cells infected with vBac-VP2 by electron microscopy. (A) Virus-like particles (VLPs) were observed in the Sf9 cells infected with vBac-VP2 by negative staining of electron microscopy. (B) “Inclusion body-like”structure were observed in the Sf9 cells infected with vBac-VP2 by ultra-section of electron microscopy.

2.5 重組Vp2蛋白的純化

Sf9細胞表達的Vp2蛋白經HisTrap HP親和層析柱純化后，進行 SDS-PAGE，用凝膠圖像分析軟件BandScan5.0分析，重組Vp2蛋白的純度達80%(圖 4)。

2.6 重組Vp2蛋白的應用

2.6.1IBDV抗體間接ELISA檢測方法的建立

用純化的重組 Vp2蛋白做包被抗原建立的IBDV抗體間接ELISA檢測，IBD疫苗 (B87株) 免疫 20 d后的雞血清 (陽性血清) 檢測孔A450值≥0.90，而 SPF雞血清、牛血清以及 PBST對照孔的A450值均為0.00，表明該ELISA抗體檢測方法具有良好的特異性 (表1)。

2.6.2重組Vp2蛋白的免疫攻毒試驗

重組 Vp2蛋白加免疫佐劑組，隨著免疫時間和免疫次數的增加，免疫雞血清中IBDV的ELISA抗體與病毒中和抗體不斷上升 (圖 6)。第 1次免疫14 d后，重組Vp2蛋白加免疫佐劑組的ELISA抗體效價為800，病毒中和抗體效價為1 106，此時用IBDV強毒攻擊，在攻毒后的第2天開始有死亡，第3天死亡較多，至第7天攻毒雞的存活率為30%(9/30)；而單用免疫佐劑組與空白對照組 ELISA抗體效價和中和效價均小于100，用IBDV強毒攻擊，在攻毒后的第4天全部死亡。解剖檢查死亡雞的法氏囊腫大、出血、表面有膠凍樣分泌物 (圖 7)；病理組織學檢查可見法氏囊淋巴濾泡呈不同程度的萎縮、壞死，濾泡內細胞數量明顯減少，細胞破碎相多見，濾泡間質增寬，有較明顯的間質水腫 (圖8A)。同期正常飼養的對照雞生長正常，法氏囊組織也未見病理變化 (圖8 B)。第7天捕殺存活雞，各試驗組的法氏囊/體重比 (BB值) 平均值分別為：重組Vp2免疫組3.68、單用免疫佐劑組2.51、空白對照組2.35。經F檢驗，重組Vp2免疫組與兩個對照組間均有顯著差異 (P＜0.05)，而兩個對照組之間差異不顯著 (P＞0.05)。

表1 IBDV抗體間接ELISA檢測結果Table 1 Detection of anti-IBDV antibodies by indirect ELISA

圖6 重組Vp2蛋白免疫雞IBDV抗體動態Fig.6 Pattern of IBDV-antibody in chickens immunized with recombinant Vp2.

圖7 攻毒死亡雞法氏囊解剖檢查結果Fig.7 Bursa of dead chickens challenged with vIBDV.

圖8 實驗雞法氏囊病理組織學檢查結果 (HE，200×)Fig.8 Tissue slices of bursas (HE, 200×). (A) Dead chicken.(B) Normal control.

第2次免疫14 d后 (從第1次免疫起28 d)，重組Vp2蛋白加免疫佐劑組ELISA抗體效價上升到3 200，病毒中和抗體效價為2 536，此時用IBDV強毒攻擊，存活率為100% (30/30)；單用免疫佐劑組與空白對照組ELISA抗體和中和抗體效價始終小于100，攻毒雞全部死亡。死亡雞的法氏囊均呈現以上病理變化。重組Vp2免疫組的法氏囊/體重比 (4.25) 與單用免疫佐劑組 (2.24) 和空白對照組 (2.29) 均差異顯著(P＜0.05)，而單用免疫佐劑組和空白對照組之間差異不顯著 (P＞0.05) (表2)。表明重組病毒樣顆粒Vp2蛋白免疫雞可以抵抗IBDV強毒攻擊。

3 討論

長期以來，對IBD采取了以疫苗免疫接種為主的綜合性防控措施，該病的大規模流行或爆發已得到了有效控制，但難以消除，其主要原因是 IBDV具有抵抗力強、抗原與毒力容易變異以及非雞禽鳥類可成為病毒攜帶者或貯存宿主等特點，使該病極易呈地方性流行，已成為禽病防控中的重要問題，由此造成的經濟損失巨大、無法準確統計[17-20]。

病毒樣顆粒疫苗作為預防性疫苗具有以下幾個方面的優勢：不含病毒DNA，無感染性[21]；免疫原性強，可刺激機體產生特異性體液免疫和細胞免疫；穩定性好，不易失活。顆粒疫苗作為一種新型的疫苗，不僅克服了傳統的弱毒疫苗和滅活疫苗的不足，也彌補了基因疫苗的不足，在許多傳染病的防控上顯示出了良好應用前景。Antonis等[22]用在昆蟲細胞中表達的豬細小病毒vp2基因產物制備的病毒樣顆粒疫苗，在免疫佐劑的作用下，能在豬體內產生高滴度的血清抗體。

表2 重組Vp2蛋白的免疫攻毒試驗Table 2 The protection test of chickens immunized with recombinant Vp2

本研究針對目前IBD基因工程疫苗研究中存在的主要問題，在目的基因選擇上，采用近期引起免疫失敗并具有完全的IBDV強毒分子特征的vp2基因，在表達系統上，利用桿狀病毒表達系統具有與高等細胞類似的翻譯后修飾系統，可使外源基因表達產物具有天然的活性形式、表達產物可自組裝成病毒樣顆粒 (VLPs)、以及表達量高等優點，將IBDV近期流行毒株的vp2基因在昆蟲細胞中進行了表達。檢測證明，重組Vp2蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒，在感染細胞中形成“包涵體樣”結構，細胞培養物的ELISA效價達到1.6×103，得到了高效表達。

為了評估該病毒樣顆粒重組Vp2蛋白的應用前景，用重組Vp2蛋白作為IBDV抗體檢測抗原，建立了IBDV抗體間接ELISA檢測方法，檢測結果表明，該方法具有良好的特異性。由于雞體內不可能存在抗昆蟲細胞抗體，因此使用在昆蟲細胞中表達的病毒樣顆粒重組Vp2蛋白作為IBDV抗體檢測抗原研制IBD抗體檢測試劑盒可以有效地保證檢測方法的特異性。已有的研究表明，免疫效果和生產成本是影響獸用基因工程疫苗推廣應用的主要因素，鑒于此，本實驗簡化疫苗制備工藝，用重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細胞裂解物免疫SPF雞，可誘導機體產生高效價的抗IBDV的ELISA抗體與中和抗體，抵抗 IBDV強毒攻擊，免疫保護雞未顯任何臨床癥狀和病理變化，法氏囊/體重比高于對照組，具有成為新型IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙绲臐摿?。由于目前缺乏IBDV病毒樣顆粒重組Vp2蛋白免疫攻毒試驗參考資料，本試驗的免疫劑量和免疫途徑、IBDV攻毒時機和劑量都是根據作者自己的工作經驗初步確定的，因此，在免疫攻毒試驗結果中，兩次免疫比一次免疫注射的保護率高，這表明對IBDV病毒樣顆粒重組Vp2蛋白的免疫劑量和免疫佐劑進行優化是必不可少的，該項工作正在進行中。以上結果表明，本實驗制備的病毒樣顆粒重組Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和檢測試劑方面顯示出了應用前景。

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Recombinant Vp2 protein of infectious bursal disease virus AH1 strain expressed in insect cells: a vaccine candidate

Wei Ouyang1,2, Yongshan Wang1, Yu Zhou1,2, Haibin Zhang2, and Yude Tang3

1Key Laboratory of Animal Diseases and Immunology,Ministry of Agriculture National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products,Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Academy of Sciences,Nanjing210014,China
2College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing210095,China
3Huadong Research Institute of Medical Biotechnics,Nanjing210002,China

Received:December 4, 2009;Accepted:March 26, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30571371), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BK2008352,BK2009041), Agriculture Science and Technology Innovation Foundation of Jiangsu Province (No. CX(08)106).

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