植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母po1h中的表達

陳云，鄒由，王一丁，馬立新

1 四川師范大學生命科學學院，成都 610101

2 湖北大學生命科學學院，武漢 430062

工業生物技術

植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母po1h中的表達

陳云1，鄒由2，王一丁1，馬立新2

1 四川師范大學生命科學學院，成都 610101

2 湖北大學生命科學學院，武漢 430062

本實驗通過 PCR方法從畢赤酵母 GS115-phyA中擴增出不含有信號肽及內含子的黑曲霉 NRRL3135植酸酶phyA基因，并將其克隆到表達載體pINA1297中，得到表達載體pINA1297-phyA，利用醋酸鋰轉化法將線性化載體轉化到解脂耶氏酵母po1h中，通過YNBcasa和PPB平板篩選出陽性表達菌株，陽性菌株在YM培養基中28℃培養6 d后酶活達到最大為636.23 U/mL。表達上清經SDS-PAGE分析得到表達植酸酶分子量約為130 kDa，但通過去糖基化處理后其分子量變為51 kDa，與理論值相符。經過酶學性質分析表明重組植酸酶最適pH為5.5，最適溫度為55℃，該酶在pH 2.0～8.0處理1 h后仍有較高酶活，并且90℃處理10 min后還有86.08%的殘留酶活，其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也較強。

黑曲霉，植酸酶，phyA基因，解脂耶氏酵母po1h

Abstract:Using the polymmerse chain reaction (PCR), we amplified the phytase genephyAfromPichia pastorisGS115-phyAinAspergillus nigerNRRL3135 without the signal peptide sequence and intron sequence,. Then, it was cloned into pINA1297 vector to generate a recombinant vector of pINA1297-phyA. pINA1297-phyAwas linearized and transformed intoYarrowia lipolyticapo1h by the lithium acetate method. The positive transformants were obtained by YNBcasaand PPB plates, after induced in YM medium at 28°C for 6 day. The activity of the expressed phytasephyAreached 636.23 U/mL. The molecular weight of the enzyme was 130 kDa measured with SDS-PAGE analysis, whereas its molecular size reduced to 51 kDa after deglycosylation which is correspond with theoretical value. The enzymatic analysis of the recombinant phytasephyArevealed its optimal pH and temperature was 5.5 and 55°C, which had high activity after incubated in pH ranged from 2.0 to 8.0 for 1 h. Moreover, its activity remained 86.08% after exposure to 90°C for 10 min. It also was resistant to pepsin or trypsin treatment.

Keywords:Aspergillus niger, phytase,phyAgene,Yarrowia lipolyticapo1h

植酸酶是一種新型的環保型“綠色”飼料添加劑，它能分解飼料中的植酸和植酸鹽形成禽畜可利用的磷酸和肌醇，提高了飼料中有機磷的利用率，減少了添加無機磷的量，降低飼料成本，減輕磷污染，并可抑制植酸對礦物質和蛋白質的親和力，解除植酸的抗營養作用[1]。而商品化植酸酶大多為來源于曲霉的植酸酶，其中由黑曲霉Aspergillus nigerNRRL3135菌株phyA基因編碼的植酸酶應用最早最廣泛[2]。

目前黑曲霉Aspergillus nigerNRRL3135菌株phyA基因已經在釀酒酵母、畢赤酵母GS115、KM71和X-33中得到表達，但還未見其在非常規酵母解脂耶氏酵母中進行表達研究，而解脂耶氏酵母被認為是安全的 (Generally regarded as safe)，因此，能用于食品和藥物生產上。在上世紀90年代解脂耶氏酵母被成功地開發為一種新的優良酵母表達系統，它能大量分泌多種代謝產物，能利用很多普通的碳水化合物和脂肪作為碳源，這也使得它更適合于不同的工業應用[3]。

1 實驗材料

1.1 菌種和質粒

重組畢赤酵母 GS115-phyA、大腸桿菌 DH10β為本實驗室保存。pINA1297載體和解脂耶氏酵母polh (CLIB882：Ura?，△AEP，△AXP，Suc+) 由法國國家科學研究中心微生物學和分子遺傳學實驗室的Catherine Madzak教授贈送。

1.2 試劑與培養基

脫糖基化酶(Endoglycosidase H)、DNA限制性內切酶購自Promega公司。T4 DNA連接酶、LATaq酶均購自寶生物工程 (大連) 有限公司。PEG4000、醋酸鋰購自Sigma公司，植酸鈣為實驗室自制，質粒 DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司。其他常規試劑采用進口分裝或國產分析純。引物合成和測序由上海英駿生物工程有限公司完成。

YEPD培養基：1.0%酵母提取物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖；篩選重組解脂耶氏酵母 po1h轉化子的YNBcasa培養基：0.17%YNB，2%葡萄糖，0.2%酪蛋白水解物；PPB[4]培養基：0.132%酵母提取物，2.0%葡萄糖，0.132% NH4Cl，0.032%KH2PO4，0.024% MgSO4·7H2O，0.033%Vitamin B1；用于重組解脂耶氏酵母po1h表達的YM[5]培養基：0.5%酵母提取物，2%麥芽膏，1%蛋白胨，1.5%葡萄糖。

2 方法

2.1 植酸酶phyA基因片段的克隆

將重組畢赤酵母菌種GS115-phyA接種于YEPD液體培養基中，28℃培養 48 h后挑單菌落轉接到YEPD液體培養基中，搖床培養至大量菌體產生。收集菌體，利用CTAB法[6]提取其基因組DNA，并檢測其抽提效果。根據植酸酶phyA基因序列[7]設計引物如下：

1297phyAF:5′-TACGGCCGTTCTGGCC ATGCT GGCAGTCCCCGCCTC-3′ (下劃線為SfiⅠ酶切位點)；1297phyAR:5′-CGGGGTACC CTAAGCAAAAC ACTCCGCCCAATCA-3′ (下劃線為KpnⅠ酶切位點)；擴增的植酸酶phyA基因的模板為GS115-phyA酵母的總DNA。PCR擴增條件：94℃5 min ；94℃30s，47℃35 s，72℃1.5min ，30個循環；72℃10 min。擴增產物用DNA回收試劑盒回收。

2.2 重組表達載體pINA1297-phyA的構建

通過PCR方法獲得帶有SfiⅠ和KpnⅠ酶切位點的植酸酶phyA基因片段，對載體pINA1297和擴增出的植酸酶phyA基因片段進行SfiⅠ和KpnⅠ雙酶切，凝膠回收后做連接，然后將連接液轉化入大腸桿菌 DH10β感受態細胞，涂布到卡那霉素抗性的LB固體平板上，放入37℃恒溫培養箱中培養14 h，分別挑取長出的單菌落接種到含有卡那霉素的 LB液體培養基中，于 220 r/min恒溫搖床中 37℃培養20 h，用堿抽提法抽提其質粒，然后進行電泳檢驗及PCR鑒定，所用引物為：F:5′-GCTACCGCCTTT ACTATTCTCACGGC-3′，R:5′-CAACGTGAGGGGA CGCCATGG-3′。最后將上述篩選出的重組子進行酶切驗證及測序分析，最終找到陽性克隆即為所要構建的解脂耶氏酵母表達載體pINA1297-phyA。

2.3 解脂耶氏酵母的轉化

從–80℃冰箱取出 50%甘油保存的解脂耶氏酵母po1h，在YEPD平板上劃線，30℃培養約18 h，將生長出的菌體懸浮到裝有1 mL 1 mol/L TE (pH 7.0)的EP管中，10 000 r/min離心1 min棄去上清，然后懸浮菌體到600 μL 0.1 mol/L醋酸鋰 (pH 6.0) 中，28℃水浴孵化1 h不振蕩。3 000 r/min離心2 min后棄去上清，輕懸菌體到80～120 μL 0.1 mol/L醋酸鋰(pH 6.0) 中便是用于轉化的感受態細胞。取 40 μL的解脂耶氏酵母po1h感受態細胞加入2 μL ssDNA和 3 μLNotⅠ線性化的重組質粒，28℃水浴孵化15 min 后加入 350 μL 1 mol/L PEG4000 (如需要可加入16 μL 1 mol/L DTT可提高轉化效率)，28℃水浴孵化1 h不振蕩，39℃熱擊 10 min，加入600 μL 0.1 mol/L的醋酸鋰 (pH 6.0) 中，迅速涂到篩選平板YNBcasa上，28℃培養 7～14 d[8]。

由于解脂耶氏酵母po1h是尿嘧啶營養缺陷型的菌株，而將含有尿嘧啶篩選標記的 pINA1297-phyA重組表達載體轉化到解脂耶氏酵母中后，重組解脂酵母便能生長在尿嘧啶營養缺陷的YNBcasa平板上，挑取長出的菌落，提取其酵母總 DNA。采用 PCR鑒定其是否為重組子[9]，所用引物為：F:5′-GCTACC GCCTTTACTATTCTCACGGC-3′，R:5′-CAACGTGG GGACAGGCCATGG-3′。反應程序：94℃ 10 min ；94℃30s，57℃45 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環。PCR產物經0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.4 高活性重組酵母菌株的篩選

將鑒定出的重組酵母菌株點接到YEPD固體平板上28℃培養2 d，然后將其點到含有0.5%植酸鈣的PPB平板上28℃培養4～7 d，挑選出水解圈大的菌株即可能為植酸酶活性較高菌株。

2.5 重組酵母菌株的表達

從PPB平板上挑取水解圈較大的重組酵母菌株接種到YM平板上28℃培養3～4 d，然后將其轉接到裝有100 mL的YM (pH 5.5) 液體培養基中，于28℃、220 r/min搖床中培養，離心培養液取上清即為重組酵母菌株分泌表達的胞外植酸酶phyA粗酶液，用12% SDS-PAGE電泳觀察結果。

2.6 重組植酸酶酶學性質測定

取上述植酸酶粗酶液在不同pH和溫度條件下，測定植酸酶酶活性。植酸酶的活性測定方法參照GB/T18634-2009進行，酶的活性單位定義為：在37℃、pH 5.5條件下每分鐘水解植酸釋放1 μmoL的無機磷所需要的酶量為1個酶活力單位，以U表示[10]。

2.7 胃蛋白酶和胰蛋白酶對酶活性的影響

分別加入500 μL濃度為0.5 mg/mL的胃蛋白酶(用pH 2.5的緩沖液配制) 和胰蛋白酶 (用pH 7.0的緩沖液配制) 到稀釋好的500 μL粗酶溶液中，然后放于37℃水浴鍋中分別處理30、60和120 min，再在常規條件下測定酶活，以未處理的酶活為100%，在其他條件下測得的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此條件的相對酶活[11]。

3 結果與分析

3.1 植酸酶phyA基因片段的克隆

在此PCR反應條件下，獲得了一條長約1.4 kb的特異性PCR擴增條帶 (圖 1)，符合phyA基因去掉信號肽和內含子后的理論長度1347 bp，可初步判斷PCR擴增phyA基因成功。

3.2 重組表達載體的構建

構建含有植酸酶phyA基因表達片段的重組表達載體pINA1297-phyA(圖2)。重組表達載體經SfiⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定后得到一條約 1.4 kb的產物(圖 3)，與預期的植酸酶phyA基因序列大小一致。重組表達載體經測序后表明重組質粒中的基因片段即為植酸酶phyA基因。由此表明 pINA1297-phyA構建成功。

3.3 酵母的轉化與篩選

將重組表達載體 pINA1297-phyA經NotⅠ線性化處理后轉化解脂耶氏酵母 po1h。經過 YNBcasa平板篩選得到重組解脂耶氏酵母的轉化子。提取酵母基因組總DNA并作為模板，用目的片段所連接的部分載體基因序列作為引物進行 PCR擴增，得到約1.4 kb的電泳帶 (圖 4)，證明重組表達載體已經成功整合入酵母基因組DNA中。

圖1 PCR擴增植酸酶phyA基因產物Fig.1 PCR products of the phytasephyAgene. 1: λ-EcoT14 marker; 2?5: PCR products; 6: control; 7: DNA of the GS115-phyA.

圖2 重組表達載體pINA1297-phyA的物理圖譜Fig.2 Physical map of recombinant plasmid pINA1297-phyA.

圖3 重組質粒pINA1297-phyA的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pINA1297-phyAby enzyme digestion. 1: λ-EcoT14 marker; 2: pINA1297; 3:pINA1297 digested withSfiⅠ; 4: pINA1297 digested withSfiⅠ andKpnⅠ; 5: pINA1297-phyA; 6: pINA1297-phyAdigested withSfiⅠ; 7: pINA 1297-phyAdigested withSfiⅠandKpnⅠ; 8: PCR product of pINA1297-phyA.

圖4 重組解脂耶氏酵母 po1h植酸酶phyA基因片段的PCR擴增Fig.4 PCR amplification ofphyAgene in recombinantYarrowia lipolyticapo1h. 1: λ-EcoT14 marker; 2?5: PCR products.

3.4 高活性重組菌株的篩選

酵母轉化子點接到含有 0.5%植酸鈣的 PPB平板上，由于重組解脂耶氏酵母表達的植酸酶能分解培養基中的植酸鈣而形成水解圈，則挑取其中水解圈較大的酵母菌落，即可能為植酸酶活性較高的菌株 (圖 5)。

3.5 植酸酶phyA基因的表達

分別收集培養重組酵母的YM培養液，離心取上清測其酶活，便篩選到了一株產酶活性較高的解脂耶氏酵母，其在培養第 6天的時候表達的植酸酶酶活達到最大為636.23 U/mL。經12% SDS-PAGE對表達產物進行鑒定，結果表明重組解脂耶氏酵母po1h分泌了約130 kDa的蛋白，其比理論的植酸酶分子量大，可能是由于植酸酶phyA基因潛在的糖基化位點所造成，所以又用脫糖基化酶endoglycosidase H處理重組解脂耶氏酵母的表達產物，形成了一條約51 kDa的蛋白帶，與植酸酶phyA基因產物的理論值相符 (圖 6)。

圖5 重組解脂耶氏酵母生長在PPB平板上Fig.5 RecombinantYarrowia lipolyticagrows on PPB plate.

圖6 SDS-PAGE分析重組解脂耶氏酵母po1h中植酸酶的表達Fig.6 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expressed in the recombinantYarrowia lipolyticapo1h. 1:protein marker; 2: thephyAphytse expressed by the recombinantYarrowia lipolyticapo1h; 3: the recombinant phytase protein was treated with Endo H.

3.6 表達產物的酶學性質

按照文獻[12]的方法配置測反應體系的緩沖液(0.2 mol/L甘氨酸緩沖液 (pH 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)；0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液 (pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)；0.2 mol/L Tris緩沖液 (pH 6.5、7.0、7.5、8.0))，研究pH對表達的植酸酶phyA酶活性的影響，以最高酶活性為 100%，其他條件下的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此 pH條件的相對酶活。實驗結果表明重組解脂耶氏酵母po1h-phyA表達蛋白在pH 2.0～2.5酶活較高，然后下降，而 pH到 5.5時則有一個高點，其與黑曲霉NRRL3135中產生的植酸酶性質相似，此酶的最適反應pH值為5.5 (圖7)。

用不同 pH的緩沖液在 37℃下處理粗酶液60 min，然后調回最適pH 5.5，在常規條件下測定酶活，考察該酶在37℃下的pH穩定性。以剩余最高酶活為 100%，其他條件下的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此 pH條件的相對酶活。從圖 8可見，pH 2.0～8.0時，該酶可保持超過80%的酶活力，可見此酶在酸性、中性及弱堿性條件中都有較強的耐受性。

圖7 重組植酸酶的最適pHFig.7 Optimal pH of the recombinant phytase activity.

圖8 重組植酸酶pH耐受性Fig.8 pH tolerance of the recombinant phytase activity.

在不同酶反應溫度下 (20℃、25℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃) 測此酶的酶活力。從圖9可見，重組植酸酶隨著溫度的增加，酶活一直呈上升趨勢，約到55℃時酶活達到最高，當溫度超過55℃后酶活開始下降，可見該酶活的最適反應溫度為55℃。

將重組植酸酶分別在70℃、80℃和90℃下保溫10 min后再在37℃、最適pH下測定酶活性，以不進行熱處理的重組植酸酶的酶活性為 100%，其他條件下的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此pH條件下的相對酶活。從圖10可以看出，重組植酸酶有好的耐熱性，在90℃處理10 min后酶活保留在86.08%。

3.7 酶的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性

隨著處理時間的延長，植酸酶活力逐漸下降。其用胃蛋白酶處理2 h后殘留酶活為97.08%，用胰蛋白酶處理2 h后殘留酶活為88.85%。該酶抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力強。

圖9 重組植酸酶最適溫度Fig.9 Optimal temperature of the recombinant phytase activity.

圖10 重組植酸酶的熱穩定性Fig.10 The thermo stabilities of the recombinant phytase activity.

4 討論

到目前為止還未見到以解脂耶氏酵母 po1h作為黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA的表達菌株報道。本實驗將黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因整合到解脂耶氏酵母po1h染色體上進行表達，并對產物進行鑒定，發現表達的植酸酶性質與理論值基本一致，但其耐熱性有所提高，該酶經90℃處理10 min，殘留酶活性為 37℃時的 86.08%。比野生型的黑曲霉NRRL 3135植酸酶phyA及在畢赤酵母X33、KM71和GS115中表達的重組黑曲霉NRRL3135的植酸酶提高很多，野生型的黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA在68℃加熱10 min后只剩余40%的活性，畢赤酵母 X33、KM71和 GS115中表達的重組黑曲霉NRRL3135的植酸酶在85℃加熱10 min的條件下，也只有50%左右的活性保留[13-14]。其更高的熱穩定性，使其在飼料制?；蚺蚧^程中引起的酶活損失少，基本能滿足飼料加工、貯藏、使用的要求，也就不會因為熱不穩定性而限制此植酸酶在飼料中的推廣和應用。

另外由于動物的胃液環境大多為酸性，小腸為近中性，本研究的植酸酶在酸性及中性都保持了大部分的酶活力，且對胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性較強，所以這種酶是比較適合作為飼料用酶。

REFERENCES

[1] Wang JH, Mu YL, Huang ZX. Purification and characterization of phytase (phytA) from genetic engineering Barm.J Yunnan Normal Univ Sci, 2003,23(1): 43?47.

王金華, 穆躍林, 黃遵錫. 基因工程菌產植酸酶 (phytA)的純化及性質初步研究. 云南師范大學學報, 2003,23(1): 43?47.

[2] Chen Z, Fu J, Bei JL,et al. Purification and comparison of enzymatic properties of two recombinant fungal phytase.J SichuanUnivSci, 2007, 44(5): 1141?1146.

陳莊, 付捷, 貝錦龍, 等. 兩種重組真菌植酸酶的純化及其酶學性質比較. 四川大學學報, 2007, 44(5):1141?1146.

[3] Zhao HY, Huang Y, Yang JK,et al.Review ofYarrowia lipolyticaexpression system.ChinJ Biopro Eng, 2008,6(3): 10?16.

趙鶴云, 黃瑛, 楊江科, 等. 解脂耶氏酵母表達系統研究進展. 生物加工過程, 2008, 6(3): 10?16.

[4] Madzak C, Tréton B, Blanchin-Roland S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeastYarrowia lipolytica.JMolMicrobiol Biotechnol,2000, 2(2): 207?216.

[5] Roth R, Moodley V, van Zyl P. Heterologous expression and optimized production of anAspergillus aculeatusEndo-1,4-b-mannanase inYarrowia lipolytica.Mol Biotechnol, 2009, 43: 112?120.

[6] Graham GC, Mayers P, Hen RT. A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis.Biotechniques, 1994, 16(1): 48?50.

[7] van Hartingsveldt W, van Zeijl CM, Harteveld GM,et al.Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) ofAspergillus niger.Gene,1993, 127: 87?94.

[8] Le Dall MT, Nicaud JM, Gaillardin C. Multiple-copy integration in the yeastYarrowia lipolytica.Curr Genet,1994, 26: 38?44.

[9] Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeastYarrowia lipolytica: a review.J Biotechnol, 2004,109: 63?81.

[10] Zou LK, Wang HN, Pan X. Expression, purification and characterization of aphyAm-phyCsfusion phytase.J ZhejiangUnivSciB, 2008, 9(7): 536?545.

[11] Rodriguez E, Porres JM, Han Y,et al. Different sensitivity of recombinantAspergillus nigerphytase (r-phyA) andEscherichia colipH 2.5 acid phosphatase (r-AppA) to trypsin and pepsinin vitro.ArchBiochemBiophy, 1999,365(2): 262?267.

[12] Wyss M, Brugger R, Kronenberger A,et al. Biochemical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphor-hydrolases): catalytic properties.Appl Environ Microbiol, 1999, 65: 367?373.

[13] Han YM, Lei XG. Role of glycosylation in the functional expression of anAspergillus nigerphytase(phyA) inPichia pastoris.Arch Biochem Biophy, 1999, 364(1):83?90.

[14] Kang W, Wang Z, Zhan DL,et al.Overexpression of phytase (phyA) gene fromAspergillus nigerNRRL3135 inPichia pastorisGS115.J Jilin Agric Univ, 2006, 28(6):623?627.

康維, 王智, 詹冬玲, 等. 黑曲霉 NRRL3135菌株植酸酶基因在畢赤酵母 GS115系統中的表達.吉林農業大學學報, 2006, 28(6): 623?627.

Expression of phytase genephyAinYarrowia lipolyticapo1h

Yun Chen1, You Zou2, Yiding Wang1, and Lixin Ma2

1College of Life Science,Sichuan Normal University,Chengdu610101,China
2College of Life Science,Hubei University,Wuhan430062,China

Received:December 10, 2009;Accepted:March 24, 2010

Corresponding author:Lixin Ma. Tel: +86-27-88661237; Fax: +86-27-88666349; E-mail: lixin_ma@hotmail.com