山羊群體遺傳多樣性的微衛星分析

許麗梅，劉丑生，張利平，王志剛，韓旭，李曉霞，常爽

1 甘肅農業大學，蘭州 730070

2 全國畜牧總站 畜禽牧草種質資源保存利用中心，北京 100193

3 河南農業大學，鄭州 450002

動物及獸醫生物技術

山羊群體遺傳多樣性的微衛星分析

許麗梅1，劉丑生2，張利平1，王志剛2，韓旭2，李曉霞1，常爽3

1 甘肅農業大學，蘭州 730070

2 全國畜牧總站 畜禽牧草種質資源保存利用中心，北京 100193

3 河南農業大學，鄭州 450002

為了保護和合理利用我國地方山羊品種遺傳資源提供理論基礎，本研究利用國際農糧組織和國際家畜研究所推薦的10對微衛星引物，結合熒光標記PCR，檢測了中國9個地方山羊品種和1個引進山羊品種的遺傳多樣性。所研究的10個品種中7個呈現出高度多態，3個呈現出中度多態。并共檢測到119個等位基因，有效等位基因數在1.4641～9.2911之間，座位平均雜合度在0.2618～0.7672之間，品種平均雜合度在0.5196～0.7024之間，其中SRCRSP23位點和河西絨山羊 (HXR) 平均雜合度最高。聚類關系 (NJ和UPGMA) 和主成分分析結果與其起源、育成歷史及地理分布基本一致。

山羊，微衛星，遺傳多樣性

Abstract:Fluorescence PCR was applied to investigate the genetic diversities of 9 indigenous Chinese goat breeds and 1 exotic breed with 10 microsatellite DNA markers recommended by the Food and Agriculture Organization of the United Nations and the International Livestock Research Institute of Animal Genetics, which provide data for the preservation and utilization of indigenous goat breeds genetic resource. We found that the 7 breeds were high polymorphic while 3 breeds were moderate polymorphic. We also detected 119 alleles, and the effective allele number ranged from 1.4641 to 9.2911. The average heterozygosity of loci and breeds respectively varied from 0.2618 to 0.7672 and from 0.5196 to 0.7024. As well as SRCRSP23 site and Hexi cashmere goat had the highest average heterozygosity. Then we analyzed the phylogenetic trees (NJ and UPGMA), and found both of them were generally in accordance with their original breeding history and localities.

Keywords:goat, microsatellite, genetic diversity

山羊為分布范圍廣、產品類型多、適應性較強的物種，因此其表現出了豐富的遺傳多樣性。我國地方山羊品種資源十分豐富，根據2004年《中國畜禽遺傳資源狀況》，我國山羊品種為 50個，地方品種有43個[1]。但近年來隨著國外優良品種的大量引入、生態環境的逐漸惡化，我國許多地方固有品種處于瀕?；驗l臨滅絕狀態。對于山羊這種幾千年來持續馴養的家畜物種，其所攜帶的優良基因一旦消失，無論是從種質資源保護的深遠意義，還是從社會生產的經濟效益考慮，都將是無法挽回的損失[2-4]。本研究利用10個微衛星位點，結合熒光引物PCR技術，利用ABI3130XL自動測序儀進行基因型判定，對10個山羊品種進行遺傳學檢測，探討品種內和品種間的遺傳多樣性和遺傳分化關系，旨在為我國地方山羊種質資源的保護和合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

10個山羊品種共計447個個體，樣品具體信息見表 1。本實驗試驗樣本均由農業部全國畜牧獸醫總站畜禽牧草種質資源保存利用中心提供。

1.2 試劑及器材

pBR322/MspⅠ購自北京華美生物工程公司；普通下游引物、rTaq酶購自大連寶生物技術有限公司；全血基因組提取試劑盒購自 TIANGEN公司；ABI3130XL測序儀、熒光引物購自美國應用生物系統公司 (ABI)，引物具體信息見表2。

表1 樣品采集信息Table 1 Sample information

表2 10個微衛星座位信息Table 2 Information of 10 microsatellite loci

1.3 血樣處理及基因組DNA提取

將冷凍的血樣在20℃水浴中解凍，用全血基因組提取試劑盒提取 DNA，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.4 PCR體系及條件

PCR 反應體系為：10×buffer 1.5 μL，Mg2+1.2～1.5 μL，引物 0.2～0.5 μL，dNTPs 1.2～1.5 μL，rTaq酶0.3 μL，ddH2O補足至15 μL。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，50℃～61℃退火1 min，72℃延伸1 min，30～36個循環；72℃延伸60 min；4℃保存。

1.5 PCR產物的檢測

PCR 擴增后，先取7 μL產物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測。然后再用ABI3130XL 測序儀進行分析。

1.6 統計分析

利用Microsatellite Toolkitve version 3.1進行數據格式的轉化；利用 GENEPOP軟件進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗；利用POPGENE軟件計算等位基因數、有效等位基因數等；利用 DISPAN軟件構建NJ和UPGMA系統發生樹[5-6]；利用MVSP軟件進行群體分化成分分析。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

微衛星DNA本身是選擇中性的，不受選擇的壓力，因此在一個理想群體中各等位基因在群體中的分布頻率應該是穩定的[7]。利用 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果見表3、4。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢驗各座位P值Table 3 ThePvalue of every locus in Hardy-Weinberg

表4 Hardy-Weinberg平衡檢驗各群體P值Table 4 ThePvalue of every population in Hardy-Weinberg

2.2 等位基因的檢測及其平均雜合度和平均多態信息含量

本實驗研究10個山羊群體的10個微衛星等位基因數據都是通過 ABI3130XL測序儀分析獲得(具體座位信息見表2)，數據用GeneMapper軟件分析。ABI3130XL檢測的部分微衛星座位結果見圖1(A、B)。

利用 Nei[8-9]公式，根據各微衛星座位等位基因頻率，計算各位點的等位基因數、有效等位基因數、期望雜合度和平均雜合度 (表5)。

圖1 座位INRA023雜合子 (A) 和座位INRABERN 185純合子 (B) 的ABI3130XL檢測結果Fig.1 Detection of loci INRA023 He (A) and loci INRABERN185 Ho (B) on ABI313OXL.

表5 各位點的等位基因數、有效等位基因數、期望雜合度、平均雜合度Table 5 Na/Ne/Exp-He/Average He of all loci

2.3 群體間的遺傳距離

用Dispan軟件計算出各品種間的遺傳距離，見表6。

2.4 10個山羊品種的聚類分析

利用Dispan軟件構建Nj和UPGMA系統發生樹，結果如圖2A、2B所示。依圖2A所示，XJ和HXR聚到一起，再和CDM聚到一起；SNB和FQ先聚到一起，然后再和CDM、HXR、XJ聚為一類；LL和JC先聚到一起，然后和MG聚到一起，再和BJ聚為一類；最后是對照品種BE。依圖2B所示，XJ和HXR聚到一起，再和CDM聚到一起，隨后依次和 SNB、BJ、FQ先聚為一類；LL和 MG先聚到一起，然后再和 JC聚到一起；最后是對照品種 BE。兩種聚類分析方法得到的聚類結果基本一致。

表6 10個山羊品種間的遺傳距離Table 6 Genetic distance between ten goat breeds

2.5 群體間遺傳分化的主成分分析

群體間遺傳分化是研究多個群體間在多個標記座位上的差異性，具有多變量的特征，因而通過主成分分析可以揭示群體間遺傳分化程度并反映群體間的遺傳關系[10-12]。利用MVSP軟件對10個山羊群體進行主成分分析，結果如圖3所示，其中第1主成分、第2主成分、第3主成分分別占總變異的31.42%、25.52%和11.77%。

圖2 10個山羊品種的DA/NJ聚類圖 (A) 和DA/UPGMA聚類圖 (B)Fig.2 DA/NJ tree (A) and DA/UPGMA tree (B) among 10 goat breeds.

圖3 10個山羊品種群體間遺傳分化的第1主成分、第2主成分、第3主成分散點圖Fig.3 Scatter plot of showing the first, the second and the third principal components of genetic differentiation among 10 goat breeds.

3 結論

3.1 Hardy-Weinberg平衡

根據Hardy-Weinberg定律，在一個沒有選擇、突變和遷移的隨機大群體中，基因頻率和基因型頻率在世代之間保持不變[1]。群體遺傳不平衡是生物體在長期自然進化過程中形成的群體特征，是遺傳資源評價、經濟性狀標記等研究中的重要內容。在生態系統中，基因的流動遵循Hardy-Weinberg定律，但由于基因突變、選擇和遺傳漂變等多種因素的作用，Hardy-Weinberg平衡往往被打破，造成基因頻率和基因型頻率的非隨機分布 (即遺傳不平衡)，其中選擇在這一過程中發揮主要作用[13]。選擇包括人工選擇和自然選擇，同時由于動物個體的體質差異，自由交配不等于隨機交配。本研究中的大部分群體處于不平衡狀態，利用P值的無偏估測對各群體和各座進行檢測，發現10個群體只在座位OARAE54(P=0.2161) 和 SRCRSP9 (P=0.4196) 上處于平衡狀態，而在其他座位都不同程度地偏離平衡；除CDM(P=0.2415)、JC (P=0.8236) 處于平衡狀態，其他群體均處于哈溫不平衡。出現這種情況的原因首先可能與樣品的采集有關，主要是由于人工不能作到隨機選擇。其次可能與樣本含量有關，樣本含量是誤差的決定因素。要把取樣誤差降低到統計學所允許的范圍之內，必須要有一個足夠大的樣本。Barker等[14]提出每個品種應分析25個個體樣品，如果樣本含量達到50個，則能夠彌補可能的失誤。在本實驗中平均每個群體有40個左右，基本滿足以上條件，研究結果可以代表整個群體的全部遺傳信息，故可以排除這點影響。最后可能與群體的繁育方式有關，由于地方品種公畜數量有限和地域的限制，長時間的自由交配導致群體遺傳不平衡。

3.2 群體遺傳多樣性

多態信息含量和平均雜合度是群體內遺傳變異的量度，可以用來描述微衛星座位的變異程度[15-16]。本實驗的10個山羊群體均表現出了多態性，平均多態信息含量大于0.5，其中HXR多態信息含量高達0.666，然后依次是XJ、CDM、BJ、SNB、JC、BJ、LL、FQ，最低的為 BE多態信息含量為 0.471，平均雜合度的結果與多態信息含量一致。10個位點中TCRVB6等位基因數最多為19個，等位基因數目最少的座位是ETH10，檢測到6個。10個群體平均有效等位基因數在 4.3～2.4之間，HXR平均有效等位基因數最多為4.3個。

本實驗的群體遺傳多樣性量度的范圍與國內其他研究結果稍有差異，狄冉[3]報道新疆山羊平均雜合度為 0.7049，多態信息含量為0.6584，HXR平均雜合度為 0.6052，多態信息含量為 0.5587；王杰等[17]用10個微衛星檢測JC平均雜合度為0.7739，多態信息含量為 0.7352。這是由于本實驗所采用的微衛星位點與其他研究不同造成的。

在本實驗中新疆山羊和河西絨山羊都表現了豐富的遺傳多樣性，這可能是由于其產區的地理環境復雜，長期不定向培育和不斷引進其他品種雜交造成的結果[18]。新疆山羊在新疆各地均有分布，是肉、毛、絨、乳兼用的地方品種，也有可能成就其豐富的遺傳多樣性。而且新疆和河西走廊這些地方皆位于古絲綢之路，中亞地區的山羊品種被引入是可能的。波爾山羊的遺傳多樣性較低，主要是由于采集數量較少；另外波爾山羊繁育歷史悠久，是世界上最優秀的肉用山羊品種，是優良公羊的重要品種來源，作為終端父本能顯著提高雜交后代的生長速度和產肉性能，國內繁育的波爾山羊數量有限，近交現象比較嚴重。

3.3 遺傳距離和聚類分析

遺傳距離的度量對品種間遺傳變異提供了一個最佳的有效而客觀的描述[19]。本研究采用 DA、DS分別構建NJ樹、UPGMA樹和計算群體間遺傳距離，并采用主成分分析進行聚類分析。Takezaki等[20]認為在物種內群體間的遺傳變異 DA是獲得準確系統發生樹的最有效方法；而 DS用于估計群體分化時間上為最優。狄冉[3]也證明了 DA用來構建進化樹的準確性。另外，本研究中NJ聚類圖自檢值相對較低，與 UPGMA聚類圖略有差異。由 DA構建的UPGMA聚類圖較符合樣本的地理分布與育種歷史。從表 6中可以看出：XJ和 HXR的遺傳距離最近(DA=0.0297)，XJ和 CDM 距離次之 (DA=0.0457)，LL和BE之間的遺傳距離最遠 (DA=1.1549)。品種間的親緣關系不僅要從地理位置和起源上來確定，還應考慮到遷移、突變、環境效應以及微衛星座位數目等其他因素的影響[21]。

根據聚類分析可以看出XJ和HXR聚為一類，再和 CDM 聚到一起，結果與山羊群體的地理分布一致[22-23]。FQ明顯有別于其他云南地方品種，這與地理位置不一致。云南省地形復雜多樣，自然氣候和生態環境類型甚多，確有研究證實鳳慶無角黑山羊有別于云南其他山羊品種。鳳慶無角黑山羊是云嶺山羊和臨滄長毛山羊經多年繁育雜交和后代選育形成的品種[24]，極可能受近交的影響。李彥屏等[25]認為鳳慶無角黑山羊從體尺、體重、生長速度、產肉性能等均有別于馬關無角山羊。此外因云南省與四川省接壤，部分地區的自然條件極為相似，也可能是造成建昌山羊、龍陵山羊和馬關無角山羊 3個遺傳距離相近的原因；也有可能是位點數和取樣數不足的原因，因為當遺傳距離期望值較低時，相對測定誤差較大，因此要準確確立較相似品種間的遺傳關系，還應在位點數和取樣個體數上多加考慮，使變異系數控制在較低水平上，進而準確區分其品種。

3.4 主成分分析

從散點圖可以看出，XJ、HXR、CDM、SNB聚為一類；JC、LL、MG聚為一類；BJ和FQ位于兩類之間；BE與其它山羊群體明顯分開。這與聚類分析結果一致，足以證明結果的可靠性。

REFERENCES

[1] Qi JF, Jia YL, He XT,et al. Report on Domestic Animal Genetic Resources in China. Beijing: China Agriculture Press, 2004: 12?13.

齊景發, 賈幼陵, 何新天, 等. 中國畜禽遺傳資源狀況.北京: 中國農業出版社, 2004: 12?13.

[2] Liu CS, Wang ZG, Li N. Current condition and countermeasure of genetic resources of endangered domestic animal and poultry in China.China Anim Husband Bull, 2004, 1: 28?31.

劉丑生, 王志剛, 李寧. 我國瀕危畜禽遺傳資源保護的現狀與對策. 中國牧業通訊, 2004, 21: 28?31.

[3] Di R. The microsatellite and SNPs study of Chinese cashmere goats [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Science, 2008.

狄冉. 中國產絨山羊微衛星和單核苷酸多態性研究[D].北京: 中國農業科學院, 2008.

[4] Simianer H, Chairman of the group. Report of the ISAG/FAO advisory group on animal genetic diversity.FAO Report, 2007.

[5] Li MH, Tapio I, Vilkki J,et al. The genetic structure of cattle populations (Bos taurus) in northern Eurasia and the neighboring Near Eastern regions: implications for breeding strategies and conservation.Mol Ecol, 2007, 16:3839?3853.

[6] Kumar S, Dixit SP, Verma NK,et al. Genetic diversity analysis of the gohilwari breed of Indian goat (Capra hircus) using microsatellite markers.Am J Anim Vet Sci,2009, 4(3): 49?57.

[7] Sheng ZL, Wu CX. Quantitative Genetics. Beijing: China Agriculture Press, 1999: 7?71.

盛志廉, 吳常信. 數量遺傳學. 北京: 中國農業出版社,1999: 7?71.

[8] Nei M. Genetic distance between populations.Am Nat,1972, 106: 283?292.

[9] Nei M, Tajima F, Tateno Y, Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data II. gene frequency data.J Mol Evol, 1983, 19: 153?170.

[10] Li XL, Valentini A. Genetic diversity of Chinese indigenous goat breeds based on microsatellite markers.J Anim Breed Genet, 2004, 121: 350?355.

[11] Pritchard JK, Stephens M, Donnell YP. Inference of population structure using multilocus genotype data.Genetics, 2000, 155(2): 945?959.

[12] Saitbekova N, Gaillard C, Ruff GO,et al. Genetic diversity in Swiss goat breeds based on microsatellite analysis.Anim Genet,1999, 30: 36?41.

[13] Pan QJ, Li XL, Min LJ,et al. Genetic co-adaptability among structural genes under the condition of genetic disequilibrium.Hereditas, 2007, 29(5): 643?648.

潘慶杰, 李曉林, 閔令江, 等. 群體遺傳不平衡條件下的遺傳共適應現象及其遺傳分析. 遺傳, 2007, 29(5):643?648.

[14] Barker JS, Bradleyd G, Fries R,et al. An integrated global program to establish the genetic relationships among the breeds of each domestic animal species.FAO Report,1993.

[15] Wang J, Liu CS, Zhang LP,et al. Individual identification and paternity testing of bulls using microsatellite.Hereditas, 2009, 31(3): 285?289.

王靜, 劉丑生, 張利平, 等. 微衛星在種公牛個體識別與親緣鑒定方面的應用. 遺傳, 2009, 31(3): 285?289.

[16] Zhong T, Ma YH, Guan WJ,et al. Genetic diversity of microsatellite DNA among ten sheep breeds.Chin J AnimVet Sci, 2008, 39(5): 555?561.

仲濤, 馬月輝, 關偉軍, 等. 10個綿羊品種的微衛星DNA多態性研究. 畜牧獸醫學報, 2008, 39(5): 555?561.

[17] Wang J, Chen MH, Huatai CR,et al. Polymorphism research of microsatellite DNA in nine Sichuan black goat breeds (populations).Chin J Anim Vet Sci, 2006, 37(11):1124?1129.

王杰, 陳明華, 華太才讓, 等. 四川 9 個黑山羊品種(群體) 微衛星DNA多態性研究. 畜牧獸醫學報, 2006,37(11): 1124?1129.

[18] Li MH, Zhao SH, Bian C,et al. Genetic relationships among twelve Chinese indigenous goat populations based on microsatellite analysis. Genet Sel Evol, 2002, 34:729?744.

[19] Zhao YH, He XH, Guan WJ,et al. Analysis of genetic diversity of chinese six goat breeds by microsatellite markers.Chin J Anim Vet Sci, 2007, 38(1): 20?24.

趙艷紅, 何曉紅, 關偉軍, 等. 中國 6個山羊群體微衛星標記的遺傳多樣性分析. 畜牧獸醫學報, 2007, 38(1):20?24.

[20] Takezaki N, Nei M. Genetic distances and restruction or phylogenetic trees from microsatellite DNA.Genetic,1996, 144: 389?399.

[21] Zhang GX, Wang ZG, Chen WS,et al. Genetic diversity and population structure of indigenous yellow cattle breeds of China using 30 microsatellite markers.Anim Genet, 2007, 38: 550?559.

[22] Yang L, Zhao SH, Li K,et al. Determination of genetic relationships among five indigenous Chinese goat breeds with six microsatellite markers.Anim Genet, 1999, 30:452?455.

[23] Zhang XF, Li L, Shen W,et al. Genetic and phylogeny status of Chaidamu goat population.Hereditas, 2005,27(1): 75?79.

張西鋒, 李蘭, 沈偉, 等. 柴達木山羊群體遺傳結構及系統地位的研究. 遺傳, 2005, 27(1): 75?79.

[24] Zhang Y, Guo CY, Gao ZY. Discussion of Yunnan province local goat breeds on germplasm.J Anim Sci Vet Med, 2008, 35(11): 163?165.

張瑩, 郭成裕, 高子堯. 云南山羊地方品種種質資源初探. 中國畜牧獸醫, 2008, 35(11): 163?165.

[25] Li YP, Zhang CL, Li WZ,et al. Investigation report of Fengqing hornless black goat on germplasm//Proceedings of the national animal genetic resources conservation and utilization symposium, 2005: 502?505.

李彥屏, 張春利, 李文章, 等. 鳳慶無角黑山羊種質資源調查報告//全國畜禽遺傳資源保護與利用學術研討會論文集, 2005: 502?505.

Genetic diversity in goat breeds based on microsatellite analysis

Limei Xu1, Chousheng Liu2, Liping Zhang1, Zhigang Wang2, Xu Han2, Xiaoxia Li1,and Shuang Chang3

1Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China
2National Animal Husbandry & Veterinary Service of the Ministry of Agriculture (MOA),Beijing100193,China
3Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China

Received:January 19, 2010;Accepted:March 17, 2010

Supported by:Ministry of Agriculture 2009 Protection Project of Animal Germplasm Resources (No. [2009]99).

Corresponding author:Chousheng Liu. Tel: +86-10-62814021; E-mail: liuchousheng@sina.com

農業部2009年畜禽種質資源保護項目 (農財發[2009]99號) 資助。