初始條件對高濃度乙醇連續發酵過程的影響及振蕩行為提高發酵效率的機理分析

申渝，葛旭萌，白鳳武

1 重慶工商大學廢油資源化技術與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067

2 大連理工大學生物科學與工程系，大連 116023

工業生物技術

初始條件對高濃度乙醇連續發酵過程的影響及振蕩行為提高發酵效率的機理分析

申渝1,2，葛旭萌2，白鳳武2

1 重慶工商大學廢油資源化技術與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067

2 大連理工大學生物科學與工程系，大連 116023

前期實驗在稀釋速率為0.027 h?1的高濃度乙醇連續發酵過程中，發現了一種長周期、寬振幅的參數振蕩現象。本實驗進一步考察了不同稀釋速率下的連續發酵過程，發現在稀釋速率為0.04 h?1條件下，也能出現類似的振蕩現象；在稀釋速率為0.027 h?1或0.04 h?1的條件下，改變系統的初始狀態可以得到振蕩和穩態兩種不同的發酵過程。比較振蕩和穩態過程的實驗數據后，發現在稀釋速率為0.04 h?1的條件下，與穩態過程相比，振蕩過程的平均殘糖濃度降低了14.8%，平均乙醇濃度提高了12.6%，平均設備生產強度提高了12.3%。進一步分析表明：與穩態過程相比，振蕩過程動力學行為不僅存在滯后，而且在相同殘糖和乙醇濃度條件下，所對應的平均比生長速率提高了53.8%。

高濃度乙醇連續發酵，振蕩，釀酒酵母，發酵效率提高

Abstract:Prior research reported the oscillatory behavior characterized by long period and high amplitude during high gravity continuous ethanol fermentations at the dilution rate of 0.027 h?1. In this paper, high gravity continuous ethanol fermentations usingSaccharomyces cerevisiaat different dilution rates were carried out. Similar oscillations were observed when the dilution rate was switched to 0.04 h?1. Both oscillatory and steady processes can be achieved at dilution rates of 0.027 or 0.04 h?1, which depends on the initial status of the fermentation system. However, compared to steady process at the same dilution rate of 0.04 h?1, the average residual sugar concentration was lowered by 14.8% for the oscillatory process, while the average ethanol concentration and productivity were increased by 12.6% and 12.3%, respectively. Further investigation revealed that besides the lag time, oscillatory processes were different from steady ones in kinetics because a higher specific growth rate can be achieved at the same residual sugarand ethanol concentrations (increased by 53.8% in average).

Keywords:very high gravity continuous ethanol fermentation, oscillation,Saccharomyces cerevisia, fermentation efficiency improvement

振蕩現象普遍存在于細菌、真菌、藻類等多種微生物的連續培養過程[1-2]。與穩態操作相比，振蕩行為難以預測和控制，因此通常選取合適的操作條件加以回避，或開發相應的弱化策略[3]；僅有少量文獻報道了振蕩過程中反應器生產能力提高的現象，對振蕩行為的利用則更為罕見[4-5]。

白鳳武等在利用普通釀酒酵母Saccharomyces cerevisia進行高濃度乙醇連續發酵的實驗中，發現在特定的稀釋速率條件下 (0.027 h?1)，會出現一種特殊的振蕩現象[6-10]：振蕩周期 (4～7 d) 和振幅 (乙醇濃度變化達20～40 g/L) 分別是以往報道的幾十和十幾倍。前期研究通過引入權值函數，建立了過程動態模型；隨后利用串聯裝填填料的管式反應器使振蕩得以弱化，并研究了其弱化機理[8-9]。但仍有以下兩個關鍵的問題有待解決：

1) 模擬結果表明，非穩態過程的參數特征強烈依賴于初始條件，但此前的振蕩過程均采用相同的起始狀態，有關初始條件對以上連續發酵過程穩定性 (及振蕩是否產生) 的影響，尚無實驗證據。

2) 前期實驗發現總稀釋速率為0.012 h?1(相對于第一級反應器的稀釋速率為 0.027 h?1) 條件下的振蕩過程發酵效率優于總稀釋速率為 0.006 h?1(相對于第一級反應器的稀釋速率為 0.013 h?1) 條件下的穩態過程[10]，但這并不能說明振蕩過程本質上發酵效率優于穩態過程。因為，振蕩過程中殘糖和乙醇濃度在一定范圍內波動，其平均發酵速率實際上是各時刻發酵速率的平均值，由于發酵動力學的非線性特征，這一平均值有可能超過在平均殘糖和乙醇濃度條件下的發酵速率，從而造成振蕩過程優于穩態過程的假象。因此，需要對發酵過程的動力學進行進一步的分析。

然而，前期實驗采用CSTR與三級管式反應器串聯的發酵系統，振蕩優于穩態的現象出現在末級反應器，而不是第一級的CSTR反應器[10]。由于末級反應器的發酵受上一級反應器發酵參數的影響，而上一級反應器的發酵參數并未測量，從而無法比較振蕩與穩態過程的動力學。因此，需要重新進行不同稀釋速率下的連續發酵實驗，以獲得充分的證據。

針對以上問題，本實驗考察了不同稀釋速率下，高濃度乙醇發酵的穩態和振蕩過程，探索了振蕩產生的必要條件；并對穩態和振蕩過程的實驗數據及動力學進行了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養方法

普通工業釀酒酵母 ATCC4126，大連理工大學生物工程系保藏。保存及活化方法見文獻[7]和[8]。

1.2 培養基

一級種子培養基 (g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨3；二級種子培養基 (g/L)：葡萄糖120，酵母粉5，蛋白胨3；發酵培養基 (g/L)：葡萄糖280，酵母粉5，蛋白胨3。

1.3 連續發酵

連續發酵在一臺全自動攪拌式發酵罐中進行，有效體積為1500 mL。將活化后的一級種子 (活化方法詳見文獻[8])按10%的比例接入裝有二級種子培養基的發酵罐內，在 pH 4.5、溫度 30℃、轉速300 r/min和通氣量0.05 vvm (無菌空氣) 的條件下培養至殘糖濃度小于1 g/L，然后按照設定的稀釋速率流加發酵培養基進行連續發酵，其他操作條件保持不變。具體方案如下：1) 連續切換稀釋速率，從0.015 h?1開始啟動連續發酵，運行一定時間以后依次切換 0.025、0.027、0.04、0.06、0.08 h?1；2) 分別培養二級種子，按稀釋速率0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 h?1重新啟動連續發酵。

以上操作方案中，每種條件下的連續發酵至少維持4 d以達到穩態，或至少經歷3個振蕩周期；然后切換稀釋速率，或進行下一批連續發酵。

1.4 分析方法

葡萄糖、乙醇和生物量濃度的測定方法參照文獻[9]。

2 結果與討論

2.1 振蕩產生的必要條件

圖1給出了6種稀釋速率下的連續發酵依次切換的過程中，殘糖、乙醇和生物量濃度隨時間的變化情況。由圖1可見，在稀釋率為0.04 h?1的條件下產生了明顯的振蕩現象，而其他稀釋速率條件下，系統均達到穩態。

前期實驗中，多次采用0.027 h?1作為起始稀釋速率，均可產生長周期、寬振幅的振蕩[6-8,10]；本實驗中，在經歷稀釋速率為0.015 h?1和0.025 h?1的連續發酵后，再將稀釋速率切換至0.027 h?1，卻沒有出現振蕩現象。

然而，當稀釋速率由 0.027 h?1切換至 0.04 h?1后，這種長周期、寬振幅的振蕩再次出現；而隨后進行的起始稀釋速率為 0.04 h?1的連續發酵過程則達到了穩態 (圖2)。

由此可見，這種振蕩行為的產生不僅依賴于一定的操作條件 (例如稀釋速率)，還依賴于系統的初始狀態。產生振蕩的條件具體總結如下：特定稀釋速率，0.027 h?1或0.04 h?1；分別對應特定的初始狀態，二級種子培養結束后直接啟動高糖連續發酵(0.027 h?1)，高糖連續發酵過程中稀釋速率從較低切換到較高值 (0.04 h?1)。

2.2 穩態與振蕩過程的發酵參數比較

表1給出了稀釋速率為0.027 h?1和0.04 h?1的條件下，穩態和振蕩過程的平均發酵參數。在二級種子培養完成后直接按 0.027 h?1稀釋速率流加發酵培養基啟動連續發酵則產生振蕩，而在稀釋率逐級遞加的條件下形成穩態；在稀釋速率0.04 h?1時卻有完全相反的結果，操作條件直接開始于稀釋率0.04 h?1時，形成穩態，振蕩只在稀釋率逐級遞加的條件下發生 (圖 1)。由表 1可見，在相同稀釋速率條件下，振蕩過程可達到較低的殘糖濃度、較高的乙醇濃度、以及較高的設備生產強度。具體表現為：在稀釋速率為0.027 h?1的條件下，平均殘糖濃度降低3.9%，平均乙醇濃度提高9.0%，平均設備生產強度提高9.1%；在稀釋速率為0.04 h?1的條件下，平均殘糖濃度降低14.8%，平均乙醇濃度提高12.6%，平均設備生產強度提高12.3%。

通常對于穩態的連續發酵過程，隨著稀釋速率的降低，系統中的殘糖濃度會進一步降低，乙醇濃度進一步升高 (如圖1及表1所示)。然而，如表1所示，振蕩過程在相同的稀釋速率下，可達到比穩態過程更低的殘糖濃度和更高的乙醇濃度；不僅如此，與較低稀釋速率 (0.027 h?1) 下的穩態過程相比，較高稀釋速率 (0.04 h?1) 下的振蕩過程，反而達到了更低的平均殘糖濃度和更高的平均乙醇濃度。為何振蕩過程的平均發酵指標與穩態過程相比會有如此顯著的提高？最初推測：可能是長時間(500～600 h) 的連續發酵使菌種的發酵性能有所提高。

圖1 依次切換稀釋速率的連續發酵過程中，殘糖、乙醇和生物量濃度隨時間的變化情況Fig.1 Residual sugar (●), ethanol (□) and biomass (○) concentrationvstime during continuous ethanol fermentations at different dilution rates.

表1 稀釋速率分別為0.027 h?1和0.04 h?1條件下的穩態和振蕩過程發酵參數比較Table 1 Comparison of fermentation performance between steady and oscillatory processes at the dilution rate of 0.027 h?1and 0.04 h?1

圖2 稀釋速率為0.04 h?1的穩態連續發酵過程中，殘糖、乙醇和生物量隨時間的變化Fig.2 Residual sugar (●), ethanol (□) and biomass (○)concentrationvstime during continuous ethanol fermentation process at a dilution rate of 0.04 h?1.

分析數據發現：圖 1中稀釋速率在 0.06 h?1和0.08 h?1下的穩態發酵過程參數，是在系統連續運行了900 h之后得到的。為考察運行時間對菌種發酵性能的影響，隨后進行了起始稀釋速率分別為0.06 h?1和0.08 h?1的連續發酵過程，雖然運行時間僅為300 h(均為穩態，數據未顯示)，但與運行時間超過 900 h的發酵過程 (稀釋速率分別為 0.06 h?1和 0.08 h?1)相比，其殘糖濃度并無顯著差異，未發現菌種的發酵性能在長時間連續發酵后有明顯改變。因此，上述振蕩過程平均發酵指標高于穩態過程的現象，其原因不在于菌種性能的差異，而在于過程本身。

2.3 振蕩過程與穩態過程的動力學及差異

對于采用CSTR反應器的連續發酵過程，系統的稀釋速率等于細胞的比生長速率；而比生長速率與底物和產物濃度有關[11-12]，通常表示為μ=f(Cs,Cp) 的非線性函數形式。理論上存在同一比生長速率對應不同殘糖和乙醇濃度的可能；而且與穩態過程相比，振蕩過程中的殘糖和乙醇濃度在較大范圍內波動，由于非線性函數的均值可能大于其自變量均值的函數值，因此振蕩過程中的平均比生長速率有可能大于相同平均殘糖濃度和平均乙醇濃度條件下穩態過程的比生長速率。以上兩種原因均可能導致更高稀釋速率對應更低殘糖濃度和更高乙醇濃度的現象，但取決于細胞生長動力學的具體形式。為此，本研究考察了高濃度乙醇連續發酵過程的動力學特征。

表2給出了高濃度乙醇連續發酵過程中，不同稀釋速率下的穩態過程實驗數據。由表2可見，在殘糖濃度和乙醇濃度為91.3～167.1 g/L和49.9～78.9 g/L的范圍內 (包括了振蕩過程所經歷的殘糖和乙醇濃度范圍：96～129 g/L和65.9～78.6 g/L)，比生長速率與殘糖濃度正相關，與乙醇濃度負相關，未發現同一比生長速率對應不同殘糖濃度和乙醇濃度的現象。

通過數據分析，發現表2中的殘糖濃度 (Cs) 與乙醇濃度 (Cp) 之間具有以下線性關系：

因此，基于表2數據的動力學模型可簡化為具有單一自變量的函數形式，具體為：

表2 連續發酵穩態過程實驗數據Table 2 Experimental data of continuous ethanol fermentation at steady states

對于圖1中稀釋速率為0.04 h?1的振蕩過程，殘糖濃度 (Cs) 與乙醇濃度 (Cp) 之間也具有與方程(1) 近似相同的線性關系：

若該振蕩過程各時刻的動力學與穩態過程相同，則各數據點所對應的比生長速率可用公式 (2)估算。圖3比較了稀釋速率為0.04 h?1的振蕩過程中，各時刻比生長速率的實測值和由公式 (2) 得到的計算值。

圖 3 稀釋速率為 0.04 h?1的振蕩過程中比生長速率實測值與計算值的比較Fig.3 Comparison of the experimental data (●) with the data predicted by model (○) for specific cell growth rates during oscillation process at the dilution rate of 0.04 h?1.

由圖 3可見，振蕩過程中實際的比生長速率明顯高于按照穩態動力學數據得到的計算值，且存在時間上的平移。因此，振蕩過程各時刻的細胞動力學與穩態并不相同，對于稀釋速率為0.04 h?1的振蕩過程，在經歷相同的殘糖和乙醇濃度條件下，其平均比生長速率 (0.04 h?1) 比穩態過程 (0.026 h?1)提高了53.8%。

對于振蕩過程與穩態過程動力學差異的報道，主要涉及細胞對環境脅迫的延遲反應 (滯后)，即細胞的比生長速率不僅與當前時刻的底物和產物濃度有關，而且與前面時刻的底物和產物濃度有關，雖然利用權值函數可模擬這種滯后現象，但比生長速率的平均值仍與穩態過程相同[13-14]。也有報道表明，細胞的比生長速率受乙醇濃度升高速率的負面影響，但其結果是振蕩過程的平均比生長速率低于穩態過程[15-17]。對于實驗中振蕩過程提高發酵效率和平均比生長速率的現象，除了利用數學模型來解釋以外，較為合理的解釋是：抑制型產物連續發酵過程中，產物濃度周期性變化給細胞提供了恢復活性的時間，因此能夠在平均產物濃度相同的條件下保證較高的平均比生長速率；乙醇屬于初級代謝產物，細胞平均比生長速率提高發酵效率也就提高。類似振蕩現象在其他產物抑制型連續發酵過程也有報道[13,15,18]，但是由于缺少相應條件下穩態過程的數據，還不能證明其他過程是否也存在提高平均比生長速率和發酵效率的現象。

3 結論

1) 高濃度乙醇連續發酵過程中的振蕩行為的產生與操作條件和系統的初始狀態有關；

2) 在相同稀釋速率下，與穩態過程相比，振蕩過程具有更低的殘糖濃度、更高的乙醇濃度和更高的設備生產強度；

3) 與穩態過程相比，振蕩過程的動力學不僅存在滯后，而且經歷相同殘糖和乙醇濃度條件下，振蕩過程的平均比生長速率明顯高于穩態過程。

符 號 說 明

Cs—— 殘糖濃度，g/L；

P——設備生產強度，g/(L·h)；

Cp—— 乙醇濃度，g/L；

t—— 時間，h；

Cx—— 生物量濃度 (干重)，g/L；

Yp/s—— 產物對底物得率，g/g；

CSTR —— 連續攪拌式反應器；

μ——比生長速率，h?1；

D——稀釋速率，h?1。

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Impact of fermentation system initial status on oscillations in very high gravity ethanol continuous fermentation process and analysis of fermentation efficiency improvement

Yu Shen1,2, Xumeng Ge2, and Fengwu Bai2

1Engineering Research Center for Waste Oil Recovery Technology and Equipment,Ministry of Education,Chongqing Technology and Business University,Chongqing400067,China
2Department of Bioscience and Bioengineering,Dalian University of Technology,Dalian116023,China

Received:December 24, 2009;Accepted:February 2, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA10Z358), National Natural Science Foundation of China (No. 20806014), Initial Science Foundation of Chongqing Technology and Business University (No. 09-56-05).

Corresponding author:Yu Shen. Tel: +86-23-62768317; E-mail: 1981shenyu@sohu.com

國家高技術研究發展計劃 (863計劃) (No. 2007AA10Z358)，國家自然科學基金項目 (No. 20806014)，重慶工商大學科研啟動項目 (No. 09-56-05)資助。