甲型H5N1流感病毒M2與HA雙基因載體疫苗在小鼠體內的免疫學評價

郭建強，姚立紅，陳愛珺，徐一，劉曉宇，舒躍龍，張智清

1 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052

2 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室 國家流感中心，北京 100052

醫學與免疫生物技術

甲型H5N1流感病毒M2與HA雙基因載體疫苗在小鼠體內的免疫學評價

郭建強1，姚立紅1，陳愛珺1，徐一1，劉曉宇1，舒躍龍2，張智清1

1 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052

2 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室 國家流感中心，北京 100052

高致病性H5N1亞型禽流感病毒 (AIV) 嚴重威脅到人類健康，因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意義。以我國分離的首株人H5N1亞型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作為研究對象，PCR擴增基質蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全長開放閱讀框片段，構建共表達H5N1亞型AIV膜蛋白基因M2和HA的重組質粒pStar-M2/HA。此外，還通過同源重組以293細胞包裝出表達M2基因的重組腺病毒Ad-M2以及表達HA基因的重組腺病毒Ad-HA。用間接免疫熒光 (IFA) 方法檢測到了各載體上插入基因的表達。按初免-加強程序分別用重組質粒pStar-M2/HA和重組腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠，共免疫4次，每次間隔14 d。第1、3次用DNA疫苗，第2、4次用重組腺病毒載體疫苗，每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于檢測體液免疫應答，末次免疫后14 d采集脾淋巴細胞用于檢測細胞免疫應答。血凝抑制 (HI) 實驗檢測到免疫后小鼠血清中的 HI活性。ELISA實驗檢測到免疫后小鼠血清中抗H5N1亞型流感病毒表面蛋白的IgG抗體。ELISPOT實驗檢測到免疫后小鼠針對M2蛋白和HA蛋白的特異性細胞免疫應答。流感病毒M2與HA雙基因共免疫的研究，為研究開發新型重組流感疫苗奠定了基礎。

H5N1亞型流感病毒，基質蛋白2，血凝素，聯合免疫

Abstract:We developed vectors expressing two antigen of H5N1 influenza virus. Based on the human H5N1 avian influenza virus strain A/Anhui/1/2005 isolated in China, we amplified the matrix protein 2 (M2) and Hemagglutinin (HA) genes by PCR and subcloned them into pStar vector to construct two genes co-expressing recombinant DNA vaccine pStar-M2/HA. After transfection of293 cells with the plasmid, we confirmed with indirect immunofluorescence assay (IFA) thatM2andHAgenes cloned on plasmid pStar co-expressed successfully. Using Ad-Easy adenovirus vector system, by homologous recombination in bacteria and packaging in 293 cells, we constructed two recombinant adenoviruses, namely Ad-M2 and Ad-HA. After infection of 293 cells with the recombinant adenoviruses, we confirmed with IFA thatM2andHAgenes cloned into adenoviruses expressed successfully. We then combined the recombinant DNA vaccine and adenoviral vector vaccines in immunization of BALB/c mice with a prime-boost regime. On day 0 and day 28, we immunized the mice with DNA vaccine and on day 14 and day 42, with recombinant adenovirus vaccines. We took blood samples before each injection and 14 days after the final injection. On day 56, we collected splenocytes from the mice. ELISA and hemagglutination inhibition (HI) assay showed that the vaccines successfully induced specific IgG antibodies against HA protein in serum of the immunized mice. ELISPOT confirmed that the vaccines successfully induced the special cellular immune response to M2 and HA protein of H5N1 influenza virus. The study on combined immunization withM2andHAgenes provided basis for development of novel influenza vaccine.

Keywords:H5N1 influenza virus, matrix protein 2 (M2), hemagglutinin (HA), combined immunization

禽流感 (Avian influenza，AI) 于1878年首發于意大利，后證實是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起。禽流感不僅給畜牧業帶來巨大的經濟損失，而且嚴重威脅到人類的健康和生命。1997年我國香港首次發現 H5N1亞型禽流感病毒 (Avian Influenza Virus，AIV) 感染人的病例，2005年10月，我國安徽省發生首例確診的人感染H5N1亞型AIV病例[1]，并分離到我國首株人 H5N1亞型 AIV(A/Anhui/1/2005)。目前已有多個國家出現H5N1亞型AIV感染人的情況。AIV在公共衛生學上的意義，使得研制高效、安全、生產工藝簡單、適合人用的AI疫苗成為病毒學工作者的重要任務。

血凝素 (Hemagglutinin，HA) 是流感病毒顆粒表面的一種糖蛋白，具有凝集紅細胞的能力，它可以識別靶細胞受體并與之結合，在病毒吸附和膜融合過程中起著重要作用，HA能誘導保護性中和抗體的產生，是流感疫苗的重要組成部分。流感病毒基質蛋白2 (Matrix protein 2，M2) 大量表達于感染細胞的表面，具有對病毒脫殼和出芽起重要作用的離子通道活性。M2蛋白不僅可以誘導機體產生抗體，而且是細胞毒性T淋巴細胞的靶抗原，因此可作為研究流感亞單位疫苗的靶蛋白。

DNA疫苗作為一種新型疫苗，可有效刺激體液和細胞免疫應答，適合在聯合免疫時作為初免疫苗使用，是一種非常安全的候選疫苗。pStar載體具有巨細胞病毒 (Cytomegalovirus，CMV) 強啟動子和內部核糖體進入位點序列 (Internal ribosome entry site，IRES)，IRES上游和下游各有一個多克隆位點(Multiple cloning site，MCS)，可用于構建雙基因共表達DNA疫苗。腺病毒載體在哺乳動物中可高效表達外源蛋白，已經廣泛應用于疫苗研究。與復制型腺病毒相比，非復制型腺病毒更為安全，而且因非復制型腺病毒以低劑量產生抗原蛋白，不裂解細胞，有利于激發長期的免疫反應[2]。已有文獻報道使用腺病毒載體表達流感病毒的 HA蛋白并獲得了較好的動物免疫效果[3-4]。

本實驗構建了重組質粒pStar-M2/HA以及重組腺病毒Ad-HA、Ad-M2，將其作為疫苗聯合免疫小鼠，對免疫效果進行評價。

1 材料和方法

1.1 材料

滅活 H5N1亞型流感病毒 (A/Anhui/1/2005)、M2及HA基因模板、馬紅細胞 (Horse red cells，HRC)、火雞紅細胞 (Turkey red cells，TRC)、受體破壞酶 (Receptor destroying enzyme，RDE) 由國家流感中心提供；雙基因共表達pStar載體、Ad-Easy腺病毒載體系統、293細胞由本室保存；表達HA單基因的重組pStar-HA由本室構建；引物合成及測序由三博遠志公司完成；各種限制性內切酶、Pyrobest DNA聚合酶、去磷酸化酶CIAP購自TaKaRa公司；pGEM-T Easy Vector購自Promega公司；DNA片段回收試劑盒、質粒DNA小量快速提取試劑盒、去內毒素質粒大量提取試劑盒購自 Qiagen公司；大片段質粒提取試劑盒購自Omega公司；DMEM培養基、胎牛血清、OPTI-MEM 購自 Gibco公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；鼠抗H5N1 M2多克隆抗體、鼠抗H5N1 HA多克隆抗體由本室制備；FITC標記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司；4～6周齡雌性 BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；DNA疫苗免疫添加 CpG基序作為佐劑，序列為：5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′，由 TaKaRa公司合成，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所蔣濤博士惠贈；包含 H5N1亞型流感病毒HA蛋白所有氨基酸殘基的肽庫 (含77條多肽) 及M2蛋白所有氨基酸殘基的肽庫 (含11條多肽) 由英國 Sigma公司合成，英國劍橋大學Medical Research Council的Chris Li博士惠贈；流感病毒 (A/Anhui/1/2005) M2蛋白完整胞外區多肽(Extracellular domain of M2 protein，M2e) 由北京華大中生科技發展有限公司合成；小鼠脾淋巴細胞分離液EZ-SepTM購自深圳達科為生物技術有限公司；ELISPOT試劑盒購自BD公司。

1.2M2和HA基因的擴增及pStar-M2/HA的構建

設計合成兩組引物分別擴增 H5N1亞型 AIV(A/Anhui/1/2005)M2及HA基因完整開放閱讀框(Open reading frame，ORF)：引物 M2-NheI-FP (5′-CTAGCTAGCATGAGTCTTCTAACCG-3′) 與 M2-EcoR I-RP (5′-CGGAATTCTTACTCCAATTCTATGT T-3′) 用于擴增M2基因；引物 HA-BamH I-FP(5′-C GGGATCCATGGAGAAAATAGTGC-3′) 與 HA-SalIRP(5′-ACGCGTCGACTTAAATGCAAATTCTGC-3′)用于擴增HA基因。將M2基因和pStar載體分別用NheI及EcoR I雙酶切后純化回收相應片段，連接、轉化大腸桿菌、酶切鑒定，重組載體命名為pStar-M2/(“/”表示 IRES序列)。再將HA基因和pStar-M2分別用BamH I、SalI雙酶切后，純化回收相應片段、連接、轉化、酶切鑒定，重組載體命名為pStar-M2/HA。使用去內毒素質粒DNA大量提取試劑盒大量制備質粒。使用 Lipofectamin 2000將pStar-M2/HA和pStar分別轉染293細胞，轉染24 h后，分別使用鼠抗M2及鼠抗HA多克隆抗體，采用間接免疫熒光 (Indirect immunofluorescence assay，IFA) 法檢測M2及HA基因的表達。

1.3 重組腺病毒載體疫苗的構建及鑒定

首先PCR擴增M2及HA基因片段 (兩組引物上游酶切位點均為SalI，下游酶切位點均為NotI)，將M2與HA基因分別克隆到穿梭載體pShuttle-CMV的 MCS，鑒定正確的重組載體分別命名為pShuttle-M2、pShuttle-HA。將這兩個載體線性化后電轉化含有pAd-Easy骨架載體的BJ5183感受態細菌，采用大片段質粒提取試劑盒提取質粒并酶切鑒定，重組腺病毒載體命名為pAd-M2、pAd-HA。將它們線性化后，使用 Lipofectamine 2000轉染 293細胞，通過顯微鏡觀察細胞病變效應 (Cytopathic effect，CPE)，出現明顯CPE (++～+++) 時收集細胞，細胞沉淀用PBS重懸，凍融4次，上清即為Ad-M2、Ad-HA病毒原液。按1∶10的比例感染新的293細胞，如此反復制備出4代重組腺病毒。將293細胞培養至90%飽和度，感染重組腺病毒，24 h 后固定細胞，分別使用鼠抗M2及鼠抗HA多克隆抗體進行IFA檢測。

1.4 小鼠實驗及免疫效果評價

將4～6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為3組 (5只/組)：1)M2、HA雙基因共免疫組 (M2HA)，分別免疫pStar-M2/HA、AD-M2及Ad-HA；2)HA單基因免疫對照組 (HA)，分別免疫pStar-HA和Ad-HA；3) 空載體陰性對照組 (NC)，分別免疫 pStar及AD-easy。采用DNA疫苗與腺病毒載體疫苗聯合免疫的方式，左右腓腸肌部位注射，100 μL/只。共免疫4次，每次間隔14 d。第1、3次用DNA疫苗，添加CpG佐劑 (重組pStar質粒為100 μg/只，CpG為10 μg/只)。第2、4次用重組腺病毒載體疫苗 (HA組與 NC組只免疫一種重組腺病毒，病毒量為2.5×108TCID50/只，M2HA組同時免疫2種重組腺病毒，Ad-M2、Ad-HA 病毒量均為 1.25×108TCID50/只)。4次免疫間隔均為 14 d，在每次免疫前和末次免疫后的 14 d采集血清用于 ELISA和血凝抑制(Hemagglutination inhibition，HI) 實驗。全程免疫結束后 14 d，處死實驗小鼠并取脾細胞樣本用于ELISPOT實驗。通過在線表位預測工具 (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl) 對蛋白抗原多肽進行分析。

2 結果

2.1M2和HA基因ORF的克隆及pStar-M2/HA的構建

以我國首株分離到的人 H5N1亞型 AIV (A/Anhui/1/2005) 的cDNA作為模板，PCR擴增M2及HA基因。H5N1流感病毒M2和HA基因片段長度分別為294 bp、1 704 bp，電泳結果顯示，兩種PCR產物大小分別與M2和HA基因片段長度一致 (圖略)。M2基因用NheI/EcoR I雙酶切后插入pStar載體IRES上游MCS，HA基因用BamH I/SalI雙酶切后插入 pStar載體 IRES下游 MCS。重組后的pStar-M2/HA用NheI/MluI雙酶切可得到約300 bp的M2基因片段 (因為HA基因中含有EcoR I位點，所以使用MCS上EcoR I外側的MluI切點代替)；用BamH I/SalI雙酶切，可得到約1700 bp的HA基因片段 (圖1)。表明M2基因和HA基因分別插入到了pStar載體IRES上游及下游的MCS。

圖1 pStar-M2/HA的酶切鑒定Fig.1 Identification of pStar-M2/HA by restriction endonuclease digestion. 1: DNA marker (DL2000); 2: pStar-M2/HA digested withNheI andMluI; 3: pStar-M2/HA digested withBamH I andSalI; 4: DNA marker (DL15000).

將pStar-M2/HA轉染293細胞，24 h后，分別使用鼠抗M2多克隆抗體及鼠抗HA多克隆抗體進行IFA，檢測到pStar-M2/HA中的M2及HA雙基因共表達 (圖2)。

2.2 重組腺病毒Ad-M2、Ad-HA的構建

用PCR方法分別擴增出M2及HA基因片段 (上游酶切位點換為SalI，下游酶切位點換為NotI)，并分別將其插入到 pShuttle-CMV上，轉化 DH5α感受態細胞，鑒定正確的重組載體分別命名為pShuttle-M2、pShuttle-HA。分別將兩種重組載體用PmeI酶切、CIAP去磷酸化后，電穿孔轉化含有pAd-Easy骨架載體的 BJ5183感受態細胞，進行同源重組。鑒定正確的重組腺病毒載體分別命名為pAd-M2、pAd-HA，將其用PacI酶切后轉染293細胞，8 d后顯微鏡下可觀察到CPE。將細胞收集、凍融、PBS重懸，上清即為pAd-M2、pAd-HA病毒原液，將其繼續感染293細胞，3 d后可出現明顯CPE(圖3)。使用相同方法構建包裝出不含外源基因的對照腺病毒，命名為Ad-easy。

2.3 IFA檢測M2及HA基因的表達

Ad-M2、Ad-HA以及Ad-easy分別感染293細胞，進行IFA檢測。使用鼠抗M2多克隆抗體可檢測到感染Ad-M2的293細胞明顯的黃綠色熒光，使用鼠抗HA多克隆抗體可檢測到感染Ad-HA的293細胞明顯的黃綠色熒光 (圖 4)，而感染 Ad-easy的293細胞使用兩種抗體均未檢測到特異性黃綠色熒光，表明兩種重組腺病毒的外源基因在 293細胞中均成功地獲得表達。

2.4 紅細胞凝集抑制實驗檢測免疫小鼠血清中特異性HI抗體

將免疫前及每次免疫后 14 d采集的小鼠血清(共5批) 進行預處理，以滅活的流感病毒A/Anhui/1/2005 (H5N1) 作為抗原，用1%新鮮TRC懸液進行HI實驗，免疫前及第1次免疫后14 d，各免疫組的小鼠血清中均未檢測到 HI活性。在第 2次免疫后14 d，M2HA免疫組檢測到了HI活性，并且隨加強免疫的進行，其HI活性逐漸升高 (P＜0.05) (圖5A)。M2HA免疫組同HA單基因免疫對照組相比，各時間點兩個免疫組之間HI效價比較接近，無統計學差異 (P＞0.05)。陰性對照組各時間點的血清均未檢測到HI活性。此外還用1%新鮮HRC懸液和1%新鮮TRC懸液進行HI對比實驗。結果顯示，全程免疫后的 M2HA免疫組使用兩種紅細胞均檢測到了 HI活性，并且使用HRC測定HI的敏感性更高 (圖5B)。M2HA免疫組同HA單基因免疫對照組相比，HI效價比較接近，無統計學差異 (P＞0.05)。

圖2 IFA法檢測pStar-M2/HA的雙基因共表達 (200×)Fig.2M2gene andHAgene of pStar-M2/HA co-expression detected by IFA (200×). (A) Detection ofM2gene expression.(B) Detection ofHAgene expression.

圖3 重組腺病毒感染293細胞的CPE (200×)Fig.3 CPE of 293 cells infected with recombinant adenovirus(200×). (A) Control 293 cells. (B) 293 cells infected with Ad-easy. (C) 293 cells infected with Ad-M2. (D) 293 cells infected with Ad-HA.

圖4 IFA法檢測重組腺病毒M2或HA基因表達 (200×)Fig.4M2orHAgene expression detected by IFA (200×). (A)M2gene expression of Ad-M2. (B)HAgene expression of Ad-HA.

2.5 ELISA檢測免疫小鼠血清中抗H5N1亞型流感病毒IgG抗體

以滅活的流感病毒 A/Anhui/1/2005 (H5N1) 作為抗原，將全程免疫后的小鼠血清預處理后進行ELISA，測定吸光度值 (OD450)。結果顯示，在血清稀釋400倍和3 200倍的條件下，M2HA免疫組吸光度值明顯大于NC組 (P<0.05)，表明M2HA免疫組小鼠血清中產生了針對流感病毒表面蛋白 (HA)的抗體 (圖6)。M2HA組與HA對照組吸光度值無明顯差異 (P＞0.05)。

圖5 HI滴度檢測Fig.5 Detection of HI titers. (A) HI titers of different groups(TRC). (B) HI titers with different red blood cells.

圖6 ELISA檢測抗流感病毒A/Anhui/1/2005 IgG抗體Fig.6 Detection of anti-influenza virus A/Anhui/1/2005 IgG antibodies.

2.6 HA表位篩選

首先通過ELISPOT實驗，從包含H5N1亞型流感病毒HA蛋白所有氨基酸殘基的肽庫 (含77條多肽，每條肽16～18個氨基酸，每兩條相鄰的肽有10個氨基酸殘基的重疊) 中初步篩選出 HA-20、HA-21、HA-22、HA-23、HA-74和 HA-75共 6條多肽。進而使用HA免疫組脾淋巴細胞通過ELISPOT實驗對這 6條多肽進行了比較。結果顯示 (圖 7)，HA-74、HA-75刺激產生IFN-γ的能力最強，其次為HA-22號、HA-23，HA-20、HA-21刺激能力最弱。HA-22、HA-23、HA-74、HA-75這4條多肽均具有較強的刺激T淋巴細胞分泌IFN-γ的能力。通過在線表位預測工具對流感病毒 (A/Anhui/1/2005) HA蛋白的抗原表位進行分析，結果顯示，該蛋白中存在23個抗原指數較高的抗原多肽，本實驗中篩選出的HA-22/23/74/75四條多肽均位于抗原性較強的位置，其序列分別對應預測的8號、9號、23號多肽序列。HA-22/23/74/75四條多肽與預測的HA蛋白表位一致性比較見表 1 (陰影部分為相應的一致性序列)。

使用刺激能力最強的 HA-74、HA-75進行ELISPOT實驗，結果顯示，M2HA免疫組小鼠均成功刺激出針對 H5N1 HA-74、HA-75的細胞免疫應答，M2HA免疫組與HA單基因免疫對照組之間無明顯差異 (P＞0.05) (圖8)。

2.7 M2表位篩選

由于流感病毒 M2蛋白胞外區疫苗在多種亞型的流感病毒感染中都有廣譜的保護作用，所以含M2基因的 DNA疫苗及腺病毒載體疫苗聯合免疫后是否能夠產生針對 M2蛋白胞外區的細胞免疫應答具有重要意義。為檢測這種免疫應答，合成了 H5N1(A/Anhui/1/2005) M2蛋白全長胞外區 (M2e)，并與M2(H5N1) 蛋白肽庫 (11條多肽) 一起進行ELISPOT檢測。結果顯示，M2e以及M2蛋白肽庫中的M2-2、M2-3和M2-6均可以較好地刺激M2HA免疫組脾淋巴細胞產生IFN-γ (圖9)，表明M2HA免疫組成功刺激出針對H5N1-M2蛋白的細胞免疫應答。通過在線表位預測工具對流感病毒 (A/Anhui/1/2005) M2蛋白的抗原表位進行分析，結果顯示，該蛋白中存在2個抗原指數較高的抗原多肽，本實驗中篩選出的M2e及 M2-2/3/6四條多肽均位于抗原性較強的位置，其序列對應預測的1號抗原多肽序列。M2e及M2-2/3/6四條多肽與預測的M2蛋白抗原多肽一致性比較見表2 (陰影部分為相應的一致性序列)。

圖7 ELISPOT檢測HA多肽刺激能力Fig.7 Comparison of HA peptides for ELISPOT.

圖8 不同免疫組ELISPOT比較Fig.8 Comparison of ELSPOT results among different groups.

圖9 M2多肽ELISPOT結果Fig.9 ELISPOT result of M2-Pep.

表1 HA-22/23/74/75四條多肽與預測的HA蛋白抗原多肽一致性比較Table 1 Comparability between HA-22/23/74/75 and predicted antigenic peptides

表2 M2e及多肽M2-2/3/6與預測的M2蛋白抗原多肽一致性比較Table 2 Comparability between M2e/M2-2/M2-3/M2-6 and predicted antigenic peptides

3 討論

目前使用的流感滅活疫苗不能刺激產生細胞免疫應答，并且需要在雞胚中傳代，生產工藝復雜，無法及時生產足夠的疫苗來應對新出現的毒株以阻止流感大流行[5]。所以尋求一種能更有效地預防流感病毒感染的新型疫苗迫在眉睫，而DNA疫苗和腺病毒載體疫苗就是其中比較有發展前景的流感疫苗策略。DNA疫苗和腺病毒載體疫苗作為新的疫苗策略，不需雞胚傳代，能夠誘導體液免疫應答和細胞免疫應答，并且構建方法簡單，性質穩定。它們帶有的抗原成分在機體內合成，能進行正確的翻譯后修飾和折疊，以天然構象的形式呈遞給免疫系統。目前許多研究表明，采用 DNA疫苗與腺病毒載體疫苗聯合免疫的方法，能誘導較強的免疫反應，并有助于減弱病毒載體所導致的非特異反應，增強由目的蛋白所誘導的特異性細胞免疫反應。因此本實驗采用了 DNA疫苗與腺病毒載體疫苗聯合免疫的方式。

本研究中應用的人5型腺病毒 (Ad5) 載體天然宿主是人，Ad5在人群中的感染率較高，預先存在的Ad5特異性抗體可能減弱免疫效果，如將來繼續開展人用疫苗研究，就要充分考慮降低人體對于腺病毒載體本身的免疫反應。除了以DNA疫苗與腺病毒聯合免疫的方式外，可以通過對腺病毒表面進行修飾，例如將聚乙二醇與腺病毒交聯，以降低其免疫原性，延長在體內的存在時間。還可以選用無腸型腺病毒載體或微小腺病毒載體。研究表明，使用此類載體，可明顯減少針對載體的中和抗體，增加其在體內的存在時間和目的基因表達量[6]。另外，采用非人型腺病毒作為疫苗載體也是一種有效的方法。Singh等[7]研究表明，采用牛腺病毒為載體構建的疫苗能夠有效降低針對載體的中和抑制效應。

當前的流感疫苗主要是針對誘導產生中和抗體的表面糖蛋白HA和NA，由于HA和NA經常發生抗原轉變和抗原漂移，使其抗原性表現出很大的變異，給流感防治帶來極大的困難。與HA和NA不同，M2蛋白 (特別是胞外區) 氨基酸序列高度保守[8]，并且有研究表明 M2蛋白抗血清具有抑制流感病毒復制的功能[9-10]。因此，M2分子有可能作為具有交叉保護能力的“通用流感疫苗”以解決HA、NA變異所導致的疫苗更換毒株問題。由于 HA是流感疫苗最重要的抗原成分，M2作為抗原對流感病毒具有一定的通用免疫保護作用，因此，進行M2與HA雙基因共免疫，刺激宿主既產生針對 H5N1亞型流感病毒較強的保護作用，又能產生針對其他多種流感病毒的通用保護作用，具有重要意義。本研究結果顯示，M2、HA雙基因共免疫小鼠成功刺激出了針對中和抗原HA蛋白和通用抗原M2蛋白的免疫反應。并且，同HA單基因免疫組相比，M2、HA雙基因共免疫組刺激產生的針對 HA蛋白的體液和細胞免疫應答水平沒有減弱，這與預期相符。雙基因共免疫時，不希望產生兩種蛋白之間的相互干擾。實驗中發現pStar-M2/HA中的HA基因插入到pStar-IRES下游其表達水平同HA單基因載體表達水平未有明顯降低，使得在1、3次免疫DNA疫苗時的兩免疫組的HA蛋白表達量基本相當，而M2基因的存在，并沒有影響HA基因的免疫效果。本研究表明，相對于HA單基因免疫，能夠同時表達中和抗原和通用抗原的雙基因共免疫有可能提供更理想的免疫保護效果。流感病毒M2與HA雙基因共免疫的研究，為研究開發新型重組流感疫苗奠定了基礎。

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Immunological evaluation of vector-expressedM2andHAgenes of H5N1 influenza virus in mice

Jianqiang Guo1, Lihong Yao1, Aijun Chen1, Yi Xu1, Xiaoyu Liu1, Yuelong Shu2, and Zhiqing Zhang1

1State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering,Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing100052,China
2Chinese Influenza Center,State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing100052,China

Received:November 5, 2009;Accepted:March 21, 2010

Supported by:Major Special Science and Technology Project for Prevention and Treatment of AIDS and Viral Hepatitis and Other Major Infectious Diseases (No. 2009ZX10004-710).

Corresponding author:Zhiqing Zhang. Tel: +86-10-63519655; Fax: +86-10-63532053; E-mail: zhang_zq@hotmail.com

Yuelong Shu. Tel/Fax: +86-10-63577499; E-mail: yshu@vip.sina.com

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項 (No. 2009ZX10004-710) 資助。