東鄉族內皮型一氧化氮合酶基因G894T多態性與替米沙坦降壓療效及糖脂代謝相關性研究

張永正，王玉，閔海，馬麗雅

原發性高血壓(essential hypertension，EH)是遺傳因素與環境共同作用的多基因遺傳病，具有高度遺傳異質性、遲顯性和易感基因外顯不全性，這為確定EH相關基因的研究帶來極大困難。EH候選基的研究一直受到科研人員的重視，其中種族與EH的關系很早就被關注。研究表明內皮一氧化氮合酶(eNOS)是左旋精氨酸一氧化氮途徑的關鍵酶，eNOS催化合成的一氧化氮具有擴血管、調節血流、阻止腎素-血管緊張素的產生、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制血小板聚集、黏附和白細胞趨化作用［1］，eNOS基因第7個外顯子的突變即894位堿基G變成T(G894T)導致GLU298ASP的錯譯，此突變影響eNOS酶表達，使NO生成減少，導致血管緊張素增加，內皮受損，血管收縮障礙導致血壓升高。有效控制血壓是降低心血管疾病患病率和病死率的關鍵，臨床觀察發現不同個體對同一降壓藥物的反應性存在差異，這種差異不能完全用年齡、性別、疾病、用藥等來解釋。這提示抗高血壓藥物對原發性高血壓患者降壓療效的個體差異可能與不同個體的遺傳異質性相關。進一步研究顯示G894T多態性中T等位基因可能是治療反應的預測因素［2］。本研究對甘肅臨夏州東鄉族270例原發性高血壓患者應用替米沙坦進行治療，旨在探討其降壓療效與內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多態性的相關性，及對高血壓并糖尿病患者糖脂代謝的影響。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選取2007年6月至2009年3月在甘肅省臨夏州人民醫院心內科住院及門診患者，均為長期生活在當地無三代以內血緣關系的東鄉族高血壓患者，共270例，其中男性189例，女性81例，年齡(55.82±8.31)歲，以2005年《中國高血壓防治指南》為高血壓患者納入標準［3］，排除繼發性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病及腎功能衰竭者。選出符合條件的40例高血壓合并糖尿病患者。糖尿病入選標準符合糖尿病診斷標準:按空腹血糖＞7.0 mmol/L，餐后血糖 ＞11.1 mmol/L，排除嚴重肝腎功能不全，血肌酐 ＞180 μmol/L，繼發性高血壓，糖尿病腎病及應用胰島素治療患者。該40例患者采用飲食，運動，口服藥物(二甲雙胍、拜糖平)等綜合手段血糖控制在合理范圍內。對受試對象均簽署知情同意書，經2周安慰劑洗脫，均進入試驗程序。

1.2 方法

1.2.1 實驗前測定臨床指標 調查時測量身高、體重、體重指數(BMI)、血壓及空腹靜脈血，檢測空腹血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血尿酸。

1.2.2 給藥過程 入選270例患者每日早8時口服替米沙坦40 mg，治療4周。4周后測量血壓，其中40例糖尿病患者繼續治療至第10周后檢測空腹血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C、血尿酸。

1.2.3 DNA的提取 采用血液基因組DNA小量抽提試劑盒(上海生工血液基因組DNA小量抽提試劑盒)抽提基因組DNA。

1.2.4 PCR擴增 PCR引物:上游引物:LotNO.AW60599.5＇-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3＇;下游引 物:Lot NO.AW60600.5 ＇-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3＇(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。PCR反應體系(50 μL反應體系):(廣東東盛生物科技有限公司)，經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結果并照相(圖1)。

圖1 eNOS基因G894T特異性PCR產物電泳圖

1.2.5 基因型的檢測 酶切反應體系15 μL，限制性內切酶 BanⅡ0.5 μL(Promega Corporation Lot238827)，10× REBuffer 1.5 μL，BSA 0.15 μL，PCR 產物 10 μL，滅菌去離子雙蒸水定容至15 μL?；靹蚝箅x心30 s，置37℃電熱水浴箱水浴8 h。產物用3%瓊脂糖凝膠電泳，穩壓電泳，100 V電壓，電泳45 min，EB染色，紫外燈下觀察結果并照相。

1.2.6 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件包，進行統計學分析。對研究對象的基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，基因型、等位基因頻率和組間計數資料間比較采用χ2檢驗，計量資料結果以均數±標準差(±s)表示，兩組均數間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 eNOS基因G894T多態性分析(圖2) 受檢者DNA經PCR擴增產物為248 bp片段。G等位基因存在酶切位點，而T等位基因沒有酶切位點。若在此片段中不存在894G→T位點突變，即:基因型為GG純合子，出現限制性內切酶BanⅡ的酶切位點，酶切后得到大小為163 bp和85 bp兩個長度片段;含有894G→T點突變的純合子，即TT基因型，不能被限制性內切酶BanⅡ切開，仍為一大小248 bp的長度片段;含有894 G→T點突變的雜合子基因型為GT型，酶切后既出現248 bp，又出現163 bp和85 bp長度片段。

2.2 高血壓患者基因型分布及頻率 基因分型表明，高血壓患者eNOS基因G894T存在GG純合、TT純合和GT雜合3種基因型。完成該實驗的270例患者中，GG基因型201例，GT基因型為61例，TT基因型為 8例，基因型頻率分別為 74.44%、22.59%、2.97%，G 等位基因頻率為 85.71%，T 等位基因頻率為14.29%。把等位基因頻帶入H-W公式 p+q=1，p2+2pq+q2=1，符合 Hardy-Weinberg平衡檢驗。即:所選樣本具有群體代表性。

圖2 eNOS基因G894T特異性PCR產物酶切后電泳圖

2.3 各生化及臨床指標的基線水平 隨機入選270例高血壓患者。受試者各生化及臨床指標基線水平(表1)，根據GG純合、TT純合和GT雜合3種基因型，分為GG組及GT+TT組，經檢驗兩組間年齡性別相匹配，差異無統計學意義(P均＞0.05);兩組間血糖、TG、TC相比，差異無統計學意義(P均＞0.05);兩組間收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)基線水平比較，差異無統計學意義(P均＞0.05);兩組間體重指數(BMI)比較，GT+TT組高于GG組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表1 GG組和GT+TT組臨床基本特征

2.4 eNOS基因G894T不同基因型組應用替米沙坦前后血壓變化 兩組患者治療4周后的SBP、DBP均比治療前明顯下降(P＜0.05)。GG基因型組SBP下降幅度(13.6±6.6)mm Hg大于 GT+TT基因型組 SBP下降幅度(9.2±5.7)mm Hg，差異有統計學意義(P＜0.05)。GG基因型組DBP下降幅度(11.4±4.3)mm Hg＞GT+TT 基因型組 DBP 下降幅度(8.5 ±4.4)mm Hg，差異有統計學意義(P ＜0.05)(表2、表3)。

表2 GG組和GT+TT組治療前后血壓對比(±s)

表2 GG組和GT+TT組治療前后血壓對比(±s)

注:與治療前同類血壓相比，aP＜0.05

項目 GG組(n=201)GT+TT組(n=69)164.2 ±13.9 165.5 ±14.2治療前舒張壓(mm Hg) 96.7 ±11.2 97.2 ±10.5治療后收縮壓(mm Hg) 150.6 ±10.4a 156.2 ±12.3a治療后舒張壓(mm Hg) 85.2 ±9.5a 88.7 ±10.1治療前收縮壓(mm Hg)a

表3 GG組和GT+TT組治療前后血壓降幅對比

2.5 替米沙坦治療前后血糖、血脂、血尿酸的變化選取40例高血壓合并糖尿病患者，其中GG基因型29例，GT基因型10例，TT基因型1例，經替米沙坦治療后 TG，TC，空腹血糖，LDL-C，HDL-C，血尿酸，均顯著降低(P＜0.01)(表4)，因病例數少未作基因組間比較。

表4 替米沙坦治療前后血糖、血脂、血尿酸變化表(±s)

表4 替米沙坦治療前后血糖、血脂、血尿酸變化表(±s)

注:TG:甘油三酯;TC:總膽固醇;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇;HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇;與治療前相比，aP＜0.01

項目 治療前 治療后TG(mmol/L) 2.21 ±1.02 1.71 ±0.63a TC(mmol/L) 5.38 ±1.31 4.84 ±0.87a空腹血糖(mmol/L) 6.77 ±1.07 6.36 ±0.78a LDL-C(mmol/L) 2.93 ±0.92 2.53 ±0.65a HDL-C(mmol/L) 1.20 ±0.25 1.38 ±0.23a血尿酸(umol/L) 446.56 ±110.56 378.52 ±78.95a

3 討論

替米沙坦是一個非肽類血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑，通過在AT1受體水平特異阻斷血管緊張素系統而同時阻斷了由經典途徑(腎素-血管緊張素系統)及非經典途徑產生的AngⅡ的作用，降壓效果更好，對其他激素無影響，且清除半衰期為24 h決定了降壓療效較持久［4］。

本研究選取甘肅省東鄉族人群作為研究對象，該民族的祖先主要是13世紀以后從中亞和西亞等地遷徙而來的撒爾塔人，有自己的語言和獨特的生活習慣，全民信奉伊斯蘭教。東鄉族人群生活相對封閉，主要聚居在甘肅省臨夏回族自治州東鄉族自治縣。影響血壓的環境因素:如生存環境、生活方式、飲食習慣和精神壓力等均較為一致，所選270例高血壓患者均為首診患者，減少了影響統計結果的混雜因素。

研究表明人類eNOS基因位于染色體7q35-36，全長21 kb，有26個外顯子，25個內含子，現已發現其基因存在近10個多態性位點，其中894位點堿基G被T所取代，導致編碼產物第298號氨基酸由GLU變為ASP，進而影響NO合成，參與高血壓的發生和發展［2］。目前有研究證實eNOS基因該位點多態性與高血壓發病，以及治療耐藥有相關性［5］，因此被認為是一種功能突變。進一步的研究顯示，高血壓患者eNOS基因G894T多態性可能是患者對降壓治療敏感性不同因之一，在難治性高血壓病例中，T等位基因頻率較高［2］。Juchymova 等［2］研究了波西米亞地區的高加索人群中85例正常對照者和119例高血壓患者，發現eNOS的GLU298ASP多態性可能是患者對傳統降壓治療的抵抗因素之一。

本研究顯示，270例東鄉族原發性高血壓患者中兩組間血糖、TG、TC等生化指標相比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。GT+TT組 SBP、DBP高于GG組，BMI明顯高于GG組，而且P＜0.05，差異有統計學意義。這提示eNOS基因G894T多態性T等位基因變異與BMI升高之間的交互作用對高血壓的發病可能有一定作用。Benjafield等［6］研究顯示，G894T變異者BMI可顯著升高且存在劑量-反應關系，與本研究結論相一致。Lapu等［7］在中國重慶對eNOS G894T多態性的研究結果是，eNOS不直接導致高血壓，但可能通過與其他危險因子起到升高血壓的作用。王叢等［8］對內蒙古地區蒙古族的研究認為，G894T多態性是高血壓病的獨立危險因素，提示EH易感基因的作用可能具有地域性，而新疆哈薩克族eNOS基因G894T多態性與EH不相關［9］。本研究在用藥4周后SBP、DBP均比治療前有明顯下降(P＜0.05)，這提示患者對替米沙坦的降壓作用反應良好;而且GG基因型組SBP和DBP的下降幅度均大于GT+TT基因型組的下降幅度，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示G等位基因攜帶者對替米沙坦的降壓療效優于T等位基因攜帶者。這與Jachymova和國內狄群等［2，10］的研究相一致。但與王琳［11］和 Khawaja等［12］的研究有不同之處。出現上述差異可能與種族，遺傳有關［13］，遺傳環境和生活習慣相互作用可能是結論不一致的原因之一。因此eNOS基因多態性對不同患者降壓藥物的選擇具有指導意義，本研究發現替米沙坦對GG基因型的降壓療效明顯強于GT+TT基因型，說明替米沙坦療效與T等位基因有關。

本研究亞組分析也看到了替米沙坦對代謝綜合征患者糖脂代謝的影響，在應用替米沙坦治療10周后患者血糖、TG、TC、LDL-C、血尿酸均較治療前明顯下降，而HDL-C升高(P＜0.01)。替米沙坦是新一代ARBs，降壓安全有效，并且替米沙坦與胰島素增敏劑吡格列酮的化學結構相似，有選擇性激動PPAR-γ(過氧化物酶增殖體活性受體γ)的作用，因而推測其有減輕胰島素抵抗改善糖脂代謝的作用，基礎研究證實替米沙坦對胰島素抵抗大鼠可改善胰島素敏感性［14-15］。替米沙坦除了能夠增強胰島素敏感性外，還可以改善動脈粥樣硬化的多種致病決定因子，如增加脂聯素水平，減少炎癥發生，降低氧化應激等，體外研究顯示替米沙坦可以減少胰島素β細胞內脂肪酸誘導的氧化應激和NADPH氧化還原酶活性，從而證實替米沙坦有保護胰島β細胞的作用［16］。PPRA-γ激活后可降低血漿游離脂肪酸水平，促進葡萄糖進入骨骼肌，抑制脂肪細胞表達和分泌腫瘤壞死因子，降低脂肪細胞分泌脂聯素，從而改善胰島素抵抗，降低血糖和改善血脂紊亂，起到胰島素增敏作用，并具有抗炎抗氧化及保護內皮功能作用，本研究顯示在良好的降壓效果下，替米沙坦可以改善高血壓并糖尿病患者血糖及血脂水平。本研究中替米沙坦降低血糖、血脂的結果與陳遠剛［17］和Negro等［18］在糖尿病合并高血壓人群應用替米沙坦短期治療(10～12周)的結果是一致的。

本研究從分子生物學角度研究了eNOS基因G894T多態性與原發性高血壓利用藥物干預間的關系及對糖脂代謝的影響。顯示Glu298對替米沙坦治療反應優于Asp298，G等位基因攜帶者可能是臨床上選擇AngⅡ受體拮抗劑適應者。這對有條件進行基因甄別的高血壓患者有一定臨床指導意義。也顯示了替米沙坦在糖脂代謝方面其獨特的作用。但是，本研究的樣本量較小，候選基因單一，可能影響結論的準確性;需擴大樣本量并增加多個候選基因，進行聯合研究分析后加以證實。

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