復配“三酶一素”抑制劑的美白功效評價

周梅，肖軍，徐藝釗，曾日紅

（中山市嘉丹婷日用品有限公司，廣東 中山 528415）

復配“三酶一素”抑制劑的美白功效評價

周梅，肖軍，徐藝釗，曾日紅

（中山市嘉丹婷日用品有限公司，廣東 中山 528415）

本文用細胞生物學法及細胞圖像分析法對由光甘草定和MSH復配的美白劑“三酶一素”抑制劑的美白效果進行了評價。實驗結果顯示，“三酶一素”抑制劑對黑色素形成過程中各個階段的酶均能起到抑制作用。通過電鏡觀察，使用“三酶一素”抑制劑可減少黑色素細胞和黑色素瘤B16細胞，美白效果明顯。

美白；三酶一素；MSH；光甘草定

近年來，皮膚美白類化妝品的開發日趨活躍，銷售快速增長，美白產品已成為許多愛美女性必備的化妝品。然而，隨著美白化妝品的廣泛使用，暴露出來的問題也越來越引人關注。傳統皮膚美白產品中往往添加了過氧化氫、氯化銨基汞以及各種酚類衍生物等化合物，其作用機理是促使黑色素組織迅速瓦解，從而起到快速美白之功效。但這些成分對皮膚具有腐蝕性、細胞毒性和過敏性，長期使用具有極大的危害性，許多國家包括我國均已禁用。

通過抑制黑色素的合成來達到美白效果是當今美白產品發展的方向。目前，熊果苷、曲酸、維生素C以及它們的衍生物等已被廣泛應用于美白產品中，取得了一定的效果。但是，上述美白活性成分的滲透率較低，功效不夠理想，配方師往往通過添加大量美白劑來增強效果，但仍難以滿足消費者的需求。同時，隨著添加量增大，產生了許多安全隱患。例如，研究表明長期應用曲酸會引起接觸性皮炎和紅斑反應，并可能誘發婦女乳腺癌，曾在日本和臺灣地區引起極大關注；熊果苷則是通過釋放氫醌來達到美白效果，而后者的細胞毒性很大，已被禁止應用于化妝品中[1,2]。這些成分還容易導致化妝品的質量問題：熊果苷應用于配方中易引起產品變色；曲酸會與許多金屬離子螯合，特別是鐵離子產生著色的復合物，與空氣接觸緩慢氧化，在高溫下還能加速。維生素C及其衍生物存在容易氧化或吸收困難等缺點。

為此，研究和開發安全性好、質量穩定、能滿足消費者功效要求的美白產品，已成為化妝品業界亟需解決的熱門課題。本文根據黑色素形成機理，采用細胞生物學法及細胞圖像分析法，對由光甘草定和十一碳烯酰苯基丙氨酸（商品名MSH）復配的美白劑“三酶一素”抑制劑進行了美白效果評價。

1 實驗部分

1.1 黑色素的形成機理

正常狀態下人的膚色取決于黑色素的含量及其分布，美白的核心內容就是抑制黑色素的形成[1-2]。黑色素通常包括三種類型：DHI黑色素，DHICA黑色素和P H E O黑色素。D H I黑色素和D H I C A黑色素合稱優黑素（Eumelanin），也有人稱為真黑素；P H E O黑色素稱脫黑色素（Pheomelanin），也有人稱為褐黑素。

DHI黑色素是三種色素中顏色最深的一種，呈黑色到暗棕色，其相對分子質量最大，且不溶于酸堿。它由酪氨酸酶催化氧化而來，是人們通常所講的黑色素。DHICA黑色素的顏色比DHI黑色素稍淺，呈棕色，且相對分子質量也比DHI黑色素小，微溶于酸堿。PHEO黑色素顏色最淺，呈黃色到紅棕色，其相對分子質量最低，可溶于堿。

黑色素形成的生理過程可基本概括為：黑色素細胞產生黑色素；黑色素顆粒通過黑色素細胞樹枝狀突起向角朊細胞轉移；轉移至角朊細胞的黑色素顆粒隨表皮細胞上行至角質層，并隨著角質層脫落而排泄。其形成機理[3]如圖1所示。

白種人皮膚含褐黑色素居多，膚色較淺。黃種人的皮膚以優黑色素居多，膚色較深，因此其美白的主要途徑是抑制優黑色素的形成。研究表明，α-促黑細胞激素、酪氨酸酶、多巴互變酶（TRP-2）、DHICA氧化酶（TRP-1）（簡稱“三酶一素”）在黑色素的形成過程中起著重要的作用[1]，抑制“三酶一素”的生成是實現美白功能的關鍵。

1.2 “三酶一素”抑制劑——復配美白劑的美白機理

當前我國化妝品市場上的美白劑幾乎都以抑制酪氨酸酶的活性為主。由于抑制機理單一，再加上活性物的滲透性不理想，使得產品的美白效果較差。而且這些美白劑具有很大的刺激性和致敏性，過量殘留在皮膚上會給消費者帶來一些安全隱患。目前，國內外還沒有一種美白產品利用單一美白劑就能達到同時抑制α-促黑細胞激素、酪氨酸酶、TRP-2和TRP-1的目的，因此多種美白劑復配使用才能同時抑制“三酶一素”。MSH和光甘草定（Glabridin）是兩種應用于美白化妝品中的最新化合物，本實驗選擇由MSH和光甘草定復配美白劑。

1.2.1 MSH的美白機理

MSH是促黑色素細胞激素α-MSH分子的有效拮抗劑，它作用于因α-MSH引發的黑色素形成的各個階段的生化反應，從而抑制黑色素的形成。與抑制酪氨酸酶的傳統美白劑（如熊果苷、曲酸等）不同，MSH通過非抑制酪氨酸酶的途徑來阻止黑色素的產生，而且與其他美白劑配合使用效果更好。MSH在2%用量內是安全無刺激的，對光、熱均非常穩定，溶于水，可以直接加入到水相中參與乳化[4-6]。

圖1 黑色素的形成機理

1.2.2 光甘草定的美白機理

光甘草定（4-[(3R)-8,8-Dimethyl-3,4-dihydro-2H-pyrano [6,5-f]chromen-3-yl]Ben-Zene-1,3- diol）從特定品種的甘草中提取，是目前世界上公認最有效的天然美白劑。它能抑制酪氨酸酶的活性，又能抑制多巴色素互變和DHICA氧化酶的活性，是一種快速、高效、綠色的美白祛斑化妝品添加劑，具有與SOD（過氧化物歧化酶）相似的清除氧自由基的能力，以及與維生素E相近的抗氧自由基能力，還具有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、吸收紫外線、美白亮膚、祛斑的作用。光甘草定目前已在化妝品行業大量使用，如在膏霜、水、露、乳液等產品中都得到廣泛應用[7-9]。

2 結果與討論

2.1 用細胞生物學法測試“三酶一素”抑制劑的美白效果

化妝品行業的研發專家注意到，MSH與光甘草定在美白方面各自有其獨到的優勢，兩者的抑制機理各有不同，但價格都相當昂貴，應用起來成本壓力很大，因而難以推廣。如果將其加以復配，就能夠發揮協同效應，從而既能夠增強美白效果，還可以降低生產成本，生產出滿足社會需要的美白產品，并產生巨大的經濟和社會效益。光甘草定和MSH的最佳復配比例為0.01:1.0[10]，此次實驗中美白劑照此配比進行復配。

2.1.1 復配美白劑對促黑細胞激素（α-MSH）的抑制作用的測定

腦下垂體能分泌黑色素細胞刺激激素（α-MSH），它與Ⅰ型α-促黑色細胞激素受體（簡稱MC1R）結合后，通過激活環單磷酸腺苷和蛋白活化酶A來激活酪氨酸酶，促進黑色素的形成。有報道[3]指出，它還能促進黑色素細胞的分裂增殖。本實驗的機理是復合美白劑中的成分通過爭奪I型α-促黑色細胞激素受體，使得α-MSH失去受體而不能表達。

按照SEPPIC公司推薦的方法，從小鼠的黑素細胞B16/F1中提取MC1R，將MC1R放在有放射性配體（與MC1R受體有很高的親和性）的四個培養箱中培養，控制培養環境。然后分別將復配美白劑、曲酸、Vc棕櫚酸酯和熊果苷四種產品等量放入上述四個培養箱中觀察反應，實驗發現部分產品能與MC1R受體結合并且替代了放射性配體與MC1R受體的結合位置。根據取代位多少計算產品對MC1R受體的爭奪率，結果見圖2。

從圖2可以看出，在爭奪α-MSH受體方面，與其他市場上常用美白劑相比，復配美白劑對促黑細胞激素有更好的抑制效果，爭奪率大于80%。

2.1.2 復配美白劑對酪氨酸酶的抑制作用的測定

黑色素的形成過程中酪氨酸酶是主要限速酶，在從酪氨酸向多巴轉化和多巴向多巴醌轉化過程中，都是由酪氨酸酶催化進行的。酪氨酸酶直接控制著黑色素合成的起始及速度，決定了后續步驟是否能夠進行下去。因此，阻止酪氨酸酶的合成是實現美白的關鍵步驟之一。實驗按照姚莉等人[11]的方法測定了復配美白劑抑制酪氨酸酶的活性（結果見圖3）。

由圖3可以看出，美白劑在極低的濃度下也會有很好的抑制酪氨酸酶的效果，這為提高產品的安全性提供了很大的保障。

圖2 0.1%美白劑爭奪MC1R實驗

2.1.3 復配美白劑對TRP-2的抑制作用

TRP-2是一種與酪氨酸酶有關的蛋白質，其作用機理是促使所作用的底物發生重排，生成底物的某一同分異構體，最終生成另一黑色素。即在多巴色素脫羧、重排生成5,6-二羥基吲哚（DHI）的同時，黑色素細胞內部多巴色素由于多巴色素異構酶的存在而發生重排，生成5,6-二羥基吲哚-2-羧酸（DHICA）。因此，該酶主要是調節DHICA的的生成速率，從而影響所生成黑色素分子的大小、結構和種類。

實驗采用液相色譜的方法（C18-ODS柱）測得復配美白劑在抑制TRP-2方面有很高的活性（表1）。抑制率＝1－有復配美白劑時的DHICA峰÷沒有復配美白劑時的DHICA峰。

由表1可以看出，在0.5×10-3mg/mL和0.5×10-10mg/mL兩種濃度下，復配美白劑對TRP-2的抑制率相同。因此，實驗只需要少量美白劑便可達到高效抑制率，增加了產品的安全性。

2.1.4 復配美白劑對TRP-1的抑制作用

近年來對TRP-1（DHICA 氧化酶）功能的研究證明，該蛋白在黑色素合成的下游途徑中起重要作用。它能催化DHICA，最終合成DHICA黑色素，TRP-1主要通過氧化DHICA來最終合成黑色素[1]。按照Kawaguchi等人[5]的方法，使用等量復配美白劑進行TRP-1抑制實驗，結果如圖4。

由圖4可以看出，三種美白劑中，復配美白劑的抑制效率最高。結果表明復，配美白劑在抗氧化性上有非常顯著的作用。

表1 復配美白劑對多巴互變酶的抑制

圖3 復配美白劑抑制酪氨酸酶活性曲線

圖4 復配美白劑對DHICA氧化酶的抑制作用

2.2 用細胞圖像分析法測試“三酶一素”抑制劑的美白效果

用電鏡觀察使用復配美白劑5天后對體外培養的黑色素細胞的影響和對B16細胞形態的影響，結果見圖5和圖6。

對比圖5中未使用復配美白劑的對照組和使用了復配美白劑的產品組，可以看出，使用復配美白劑5天后黑色素細胞明顯的減少，對皮膚的美白效果明顯。

由圖6可以看出，使用復配美白劑5天后黑色素瘤B16細胞的數目明顯減少，美白效果顯著。

圖5 美白劑對人皮膚色素細胞的影響

圖6 復配美白劑對B16細胞形態的影響

3 結論

“三酶一素”抑制劑應用在美白護膚品中，對黑色素形成的各個階段所需要的酶進行阻斷。從生物細胞水平和細胞圖像分析可知，復配的“三酶一素”抑制劑具有明顯的美白效果。美白劑用量較少，不僅可以提高產品的安全性和功效性，而且能夠極大地降低產品成本，增強企業的市場競爭力。

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