理中湯、人參皂苷Rg1、6-姜酚對Caco-2細胞PepT1轉運功能影響的比較

郭文峰，胡 燦，劉 佳，高小玲，陳蔚文

（廣州中醫藥大學 脾胃研究所，廣東 廣州 510405）

PepT1（Peptide Transporter 1）是蛋白質消化產物小分子肽（二肽、三肽）在小腸吸收的主要轉運體，其表達和功能直接影響蛋白質消化產物的吸收水平，我們認為PepT1的功能與“脾主運化水谷精微”是密切相關的。前期動物實驗研究中觀察到脾陽虛模型大鼠小腸黏膜PepT1轉運功能增強，蛋白表達上調，理中湯治療可逆向調節這種改變［1-2］。本次實驗擬從培養Caco-2細胞模型，觀察理中湯、人參皂苷Rg1、6-姜酚對體外培養細胞PepT1表達及功能影響，并三者作用的異同。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

14C-Glycyl-Sarcosine，購自 American Radiolabeled Chemicals Inc.，批號：090731，濃度0.1mCi／mL；8-Bromoadenosine-3′，5′-cyclic mono-phosphorothioate，Rp-isomer（簡稱Rp-8-Br-cAMP），Simga公司產品，批號：029K1157；Glycyl-Sarcosine，Sigma公司產品，批號 142871122009161；PEPT1抗體：ABCAM公司產品；定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix購自TOYOBO公司；Transwell聚碳酸酯膜單細胞層培養板，嵌入膜直徑24mm，孔徑0.4μm，Corning公司產品，批號： 20109011；定量PCR儀：美國Stratagene公司實時熒光定量PCR儀Mx3005P；Millicell?-ERS跨膜電阻測定儀，美國Millipore公司產品；液體閃爍及發光儀：Perkin Elmer 1450，美國Perkin Elmer公司產品；電泳儀：PowerPac Universal，美國Bio-Rad公司產品；紫外可見光分光光度計：Beckman Coulter DU?520，德國貝克曼公司產品；凝膠成像系統：KADAK Image Station 2000MM，美國Eastman Kodak公司產品；理中湯：黨參、干姜、白術、炙甘草購自廣州市藥材公司，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定為桔?？浦参稂h參Codonosips pilosula（Franch.）Nannf.的根、姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根莖、菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.的根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖；以上4藥以1∶1∶1∶1的比例水煎煮2次合并煎液，中性濾紙過濾后，冷凍干燥備用。細胞培養試驗需要加藥時，稱取理中湯冷凍干燥粉末，用PBS溶解后，孔徑0.22μm的微孔濾器過濾后加入到細胞培養液中。人參皂苷Rg1，購自購自甙爾塔醫藥科技有限公司，純度＞98%，批號 20091027；6-姜酚（6-Gingerol，C17H26O4，CAS.23513-14-6），購自甙爾塔醫藥科技有限公司，純度＞98%，批號20091106。

1.2 細胞株

Caco-2細胞，來源于人結腸腺癌細胞，結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞。購自American Type Culture Collection（ATCC，HTB-37），Lot.No.57850025。

1.3 Caco-2細胞培養，單細胞層模型建立及給藥

取代次為25～28的Caco-2細胞。為了測定Caco-2細胞從頂膜向基底膜的14C-Glycyl-Sarcosine吸收轉運，將Caco-2細胞種植于跨膜轉運6孔培養板微孔濾膜上，初始種植密度為2.0×105／孔，每孔上、下室各加入高糖DMEM培養基2.0mL，隔日更換培養基，參照文獻［4］報道方法，待細胞長成致密單細胞層后，再連續培養28d后進行試驗。

用跨膜電阻測定方法［4］確定致密單細胞層模型的建立。將跨膜電阻測定儀的兩個電極分別插入跨膜轉運6孔培養板培養小室的上下室培養液中，讀取跨膜電阻值。加入DMEM培養基后，未種植細胞的跨膜轉運6空培養板上下室之間的跨膜電阻小于120Ω，聚碳酸酯膜上細胞形成致密細胞層后，其跨膜電阻當大于200Ω。

1.4 14C-Glycyl-Sarcosine轉運觀測

更換跨膜轉運6孔培養板上下小室中的培養基，在上室2.0mLDMEM培養基中分別加入理中湯（用PBS配制成100mg·mL-1的母液）、人參皂苷Rg1（用PBS配制成濃度為5.0mmol／L的母液）、6-姜酚（用 DMSO配制成1.0mM 的母液），使其終濃度分別為1.0mg·mL-1，50μmol·L-1，50μmol·L-1，同時設理中湯加Rp-8-Br-cAMP組，人參皂苷Rg1加Rp-8-Br-cAMP組，6-姜酚加Rp-8-Br-cAMP組，在加入等量理中湯／人參皂苷Rg1／6-姜酚的同時，加入Rp-8-Br-cAMP（用DMSO溶解，配制成濃度為5.0mmol·L-1的母液），使Rp-8-Br-cAMP的終濃度為50.0μmol·L-1，另設正常對照組，DMEM培養基中加入等體積的DMSO，每組設3個復孔。更換培養基及添加受試藥的同時，每孔在上室培養基中加入Glycyl-Sarcosine-［Gly-1-14C］及未標記的 Glycyl-Sarcosine，使Glycyl-Sarcosine終濃度為50μmol·L-1。

置于37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，分別于5、10、15、30、60、120min時取下室培養基100μL，液體閃爍計數儀測定14C-Glycyl-Sarcosine濃度，計算Caco-2單細胞層對Glycyl-Sarcosine的轉運功能，用于評價PepT1對二肽的轉運能力。

1.5 膜蛋白中PepT1蛋白表達檢測

采用westernblot方法進行。Caco-2細胞種植于6孔培養板中，培養條件和給藥方案同“1.4”項下，在給藥24h后，移去培養液，PBS漂洗2遍，根據細胞量加入相應的膜蛋白提取緩沖液，4℃輕搖15min，收集裂解液到EP管中，14000r·min-1離心15min，取上清液到新的EP管中。BCA（Bicinchoninc acid assay）法測量蛋白濃度后，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，80V恒壓50min，120V恒壓電泳至溴酚藍剛出膠底部止。低溫條件下，100V恒壓60～120min轉移電泳至聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜，取出雜交膜，TBST（Tris Buffered Saline with Tween 20）緩沖液漂洗5min，3次。5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h或4℃過夜。TBST緩沖液洗膜5min，3次。一抗稀釋液4℃過夜或37℃孵育2h。TBST洗膜5min，3次。二抗稀釋液37℃孵育1h。TBST洗膜5min，3次。蒸餾水漂洗膜2min，棄去液體，共洗3次。將化學熒光發光底物均勻地加到膜的表面，并使反應持續5min。用試劑盒提供的濾紙吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒曝光，顯影。凝膠成像系統測定條帶灰度值，以PepT1表達灰度值（IODPepT1）與同組內參GAPDH 灰度值（IODGAPDH）的比值（Ratio＝IODPepT1／IODGAPDH）為各組蛋白表達相對值，用于組間比較。

1.6 熒光定量PCR檢測SLC15A1（PepT1mRNA）表達

細胞培養和給藥方法同“1.4”項下，受試藥作用24h后。收集細胞，提取總RNA。采用紫外分光光度計測定D260／D280方法進行RNA純度檢測，確認RNA較純，無蛋白質污染。瓊脂糖凝膠電泳法進行總RNA完整性檢測。

逆轉錄：在RNase free的PCR管中，取1.0μg總RNA，稀釋至12μL。吹打均勻，置65℃保溫5min，使RNA變性。隨后立即冰上致冷，以防止RNA復性；在該PCR管中加入Oligo（dT）0.5μL、Random primer 0.5μL、10mM 三磷酸脫氧核糖核苷（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2.0μL、RNase inhibitor 0.5μL、5×RT buffer4.0μL、MMLV逆轉錄酶0.5μL。將上述20μL反應溶液30℃保溫10min，42℃保溫60min，72℃保溫10min。定量PCR：檢測序列片段大小。內參片段：18SrRNA-112bp；目的片段：AQP1-151bp。設計的引物：表達PepT1蛋白的mRNA為SLC15A1，qh-SLC15A1-F1：5’CTGCCCTGAAGTGAAGGTGT，qh-SLC15A1-R1：5’GATCTCCGCTGGGTTGATGT。反應體系總體積20.0μL：cDNA（1：15）5.0μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10.0μL、dH2O4.0μL。反應條件：預變性95℃5min，95℃15s，65℃15s，72℃20s讀板，40cycles。融解曲線分析：溫度60℃～95℃，每分鐘讀1次。

以SLC15A1熒光值（qSLC15A1）與內參18s熒光值（q18s）的比值，即SLC15A1相對值＝qSLC15A1／q18s，用以判斷SLC15A1表達水平的高低。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 單細胞層模型建立

Caco-2細胞融合后，繼續常規培養28天，跨膜電阻測定結果表明致密單細胞層模型已經形成，空白對照孔電阻為110Ω，試驗孔跨膜電阻測定結果均大于230Ω。表明單細胞層結構致密，可用于模擬腸上皮細胞吸收轉運試驗。

2.2 各組14C-Glycyl-Sarcosine轉運測定結果

液體閃爍計數儀測定14C-Glycyl-Sarcosine量，通過已知濃度樣品測定結果制作標準曲線，計算對應Glycyl-Sarcosine濃度。各組別細胞Glycyl-Sarcosine吸收轉運量及其與不同時間點之間的關系如表1所示。

表1 各組Caco-2細胞轉運Glycyl-Sarcosine量的比較（n＝3，）

表1 各組Caco-2細胞轉運Glycyl-Sarcosine量的比較（n＝3，）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與理中湯組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；與人參皂苷組 Rg1組比較，5）P＜0.05，6）P＜0.01；與6-姜酚組比較，7）P＜0.05，8）P＜0.01。

4±0.54 Rp-8-Br-cAMP組 1.48±0.70 1.98±0.72 2.81±0.56 4.42±0.631） 4.71±0.831）理中湯 1.63±0.31 4.52±0.571） 6.34±0.572） 7.29±0.641） 8.23±0.671）理中湯+Rp-8-Br-cAMP 1.74±0.42 2.68±0.463） 4.13±0.464） 6.45±0.68 6.73±0.432）3）人參皂苷Rg1組 1.81±0.14 3.86±0.341） 5.18±0.542） 8.08±0.752） 8.56±0.422）Rg1+Rp-8-Br-cAMP組 2.11±0.48 2.95±0.325） 3.39±0.655） 4.70±0.706） 4.90±0.362）6）6-姜酚組 1.58±0.42 2.61±0.61 4.49±0.63 6.84±0.461） 8.61±0.542）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP組 1.61±0.45 2.13±0.52 3.76±0.55 6.02±0.59 6.92±0.677）5min 15min 30min 60min 120min正常對照組 1.53±0.14 2.42±0.68 3.15±0.76 5.62±0.20 6.5組別 Glycyl-Sarcosine吸收轉運累計量（μmol／孔）

從表1結果可知，理中湯、人參皂苷Rg1及6-姜酚均在不同程度上表現為促進Caco-2細胞轉運Glycyl-Sarcosine的作用，與未經藥物處理的正常對照組Caco-2細胞比較，其累計轉運Glycyl-Sarcosine的總量明顯增加（P＜0.05），理中湯及人參皂苷Rg1起效較快，在給藥15min后即明顯高于對照組，6-姜酚增加Caco-2細胞轉運Glycyl-Sarcosine的作用表現較為緩慢，于60min后明顯高于正常對照組。

cAMP的抑制劑Rp-8-Br-cAMP對Caco-2細胞轉運Glycyl-Sarcosine有抑制作用，且能抑制理中湯及人參皂苷Rg1促進Caco-2細胞二肽轉運的作用，理中湯合用Rp-8-Br-cAMP后，Caco-2細胞轉運Glycyl-Sarcosine累計總量于15min至120min時分別明顯低于單用理中湯處理組。Rp-8-Br-cAMP對6-姜酚的作用不如其對理中湯及人參皂苷Rg1的作用明顯。

2.3 各組PepT1蛋白表達westernblot試驗結果

圖1 PepT1蛋白表達結果

結果表明，Caco-2細胞經理中湯／人參皂苷Rg1／6-姜酚處理24h后，細胞膜PepT1蛋白表達水平均明顯增高，而Rp-8-Br-cAMP顯著降低膜PepT1蛋白表達水平，Rp-8-BrcAMP與6-姜酚合用，可抑制6-姜酚增加Caco-2細胞膜PepT1表達的作用，其PepT1蛋白表達水平接近空白對照組，低于單用6-姜酚組（P＜0.05）。Rp-8-Br-cAMP與理中湯及人參皂苷Rg1合用對理中湯及人參皂苷Rg1增減Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達的作用未見明顯影響。見表2。

表2 理中湯對Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達的影響（）

表2 理中湯對Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達的影響（）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與理中湯組比較，3）P＜0.05；與6-姜酚組比較，7）P＜0.05。

組別 n Ratio值正常對照組3 0.220±0.019 Rp-8-Br-cAMP組 3 0.073±0.0182）理中湯 3 0.326±0.0312）理中湯+Rp-8-Br-cAMP 3 0.248±0.0273）人參皂苷Rg1 3 0.308±0.0281）Rg1+Rp-8-Br-cAMP 3 0.323±0.0192）6-姜酚組 3 0.317±0.0222）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP組 3 0.249±0.0217）

2.4 各組SLC15A1表達熒光定量PCR檢測結果

表3結果表明，Rp-8-Br-cAMP處理24h后SLC15A1表達明顯下調（P＜0.01）。6-姜酚能明顯上調Caco-2細胞SLC15A1表達，但合并應用Rp-8-Br-cAMP后，6-姜酚上調SLC15A1表達的作用被明顯抑制。人參皂苷對Caco-2細胞SLC15A1表達的作用表現為下調，理中湯對Caco-2細胞SLC15A1表達作用不明顯。

表3 理中湯對Caco-2細胞SLC15A1表達的影響（）

表3 理中湯對Caco-2細胞SLC15A1表達的影響（）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與6-姜酚組比較，7）P＜0.05。

組別 復孔數 SLC15A13 2.83±0.18 Rp-8-Br-cAMP組 3 1.94±0.102）理中湯 3 2.61±0.26理中湯+Rp-8-Br-cAMP 3 2.72±0.24人參皂苷Rg1 3 2.31±0.231）Rg1+Rp-8-Br-cAMP 3 2.57±0.356-姜酚組 3 3.71±0.232）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP組 3 2.94±0.217）相對值正常對照組

3 討論

脾陽虛動物模型小腸黏膜上皮PepT1表達及其轉運二肽的能力有明顯改變，溫陽健脾方理中湯對這種改變具有治療作用［1-2］。體外培養Caco-2細胞試驗研究結果顯示［5］，理中湯具有促進正常培養Caco-2細胞轉運二肽化合物Glycyl-Sarcosine的作用，該作用可能與其促進胞漿中PepT1蛋白嵌入胞膜中發揮轉運二肽的功能有關，該過程調控與胞內第二信使cAMP有一定的關系。

本研究結果中，理中湯全方、人參皂苷Rg1、6-姜酚均可促進Caco-2細胞轉運二肽化合物Glycyl-Sarcosine，且與cAMP的抑制劑Rp-8-Br-cAMP合用時表現為明顯的抑制，表明二肽化合物經由細胞膜中肽轉運載體PepT1的轉運與胞內信使cAMP的參與有關。

蛋白表達實驗結果中，理中湯全方、人參皂苷Rg1、6-姜酚均能增加Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達，合并運用胞內cAMP抑制劑Rp-8-Br-cAMP后，理中湯及6-姜酚上調Caco-2細胞PepT1蛋白表達的效應受到抑制（P＜0.05），而Rp-8-Br-cAMP對人參皂苷Rg1的促Caco-2細胞PepT1蛋白表達并無明顯作用。分析其原因，可能與三者作用的具體機制分別相關，具體機制有待進一步研究觀察予以揭示。

表達肽轉運載體蛋白PepT1的基因為SLC15A1，我們采用熒光定量PCR方法檢測了經過Caco-2細胞SLC15A1基因的表達情況，結果表明，6-姜酚對SLC15A1也有明顯上調作用，與蛋白表達結果及細胞轉運二肽化合物Glycyl-Sarcosine的測定結果基本一致。而人參皂苷Rg1對SLC15A1基因表達的作用反而表現為下調，其結果與二肽轉運結果不一致，推測可能由于人參皂苷Rg1可促進胞漿中已有的PepT1蛋白嵌入頂膜發揮二肽轉運作用有關，且本次研究受試藥作用時間較短，其下調基因表達的效應尚未影響到PepT1蛋白的總量及轉運能力。

方劑配伍規律的研究一直是中醫藥科研的熱點，諸多學者從藥理學、藥物化學等各個領域開展了大量的研究工作，也取得了長足的進展，為闡明中醫復方的配伍規律奠定了一定的工作基礎。本次研究，通過比較人參皂苷Rg1、6-姜酚及理中湯全方對Caco-2細胞PepT1蛋白轉運能力、蛋白及mRNA表達的作用，發現三者作用各有分別，可為理中湯的配伍規律提供實驗依據。

［1］DANIEL H.Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport［J］.Annu Rev Physiol，2004，66（3）：361-384.

［2］郭文峰，羊燕群，高小玲，等.脾陽虛大鼠肽轉運載體蛋白表達級轉運功能的改變［J］.時珍國醫國藥，2010，21（10）：2665-2667.

［3］郭文峰，羊燕群，潘懷耿，等.理中湯對脾陽虛大鼠模型PepT1及其轉運功能的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（1）：8-11.

［4］BARRINGTON R，WILLIAMSON G，Bennett RN，et al.Absorption，Conjugation and Efflux of the Flavonoids，Kaempferol and Galangin，Using the Intestinal CACO-2／TC7 Cell Model［J］.J Funct Foods.，2009，1（1）：74-87.

［5］郭文峰，楊偉鵬，王怡薇，等.理中湯對Caco-2細胞PepT1轉運功能的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（10）：178-181.