南瓜多糖水解工藝優化研究

杜秉健，李全宏

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，農業部果蔬加工重點開放實驗室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083)

南瓜多糖水解工藝優化研究

杜秉健，李全宏*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，農業部果蔬加工重點開放實驗室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083)

南瓜資源豐富，本實驗從利用南瓜中的重要成分南瓜多糖入手，研究了時間(x1)、溫度(x2)和酸濃度(x3)對酸水解南瓜多糖制備低聚糖工藝的影響，通過響應面法優化的最佳工藝為:時間171min;溫度64℃;硫酸濃度7.3%。在這個條件下獲得的總糖含量為33.362mg/mL，同時平均聚合度為3000，達到了保護多糖含量的同時實現南瓜多糖的可控降解的目的，為南瓜的深加工利用和提高附加值提供了新的途徑。

南瓜，多糖，酸水解，響應面

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜 新鮮、無病蟲害、充分成熟，市售;3，5-二硝基水楊酸顯色劑(DNS試劑) 取3，5-二硝基水楊酸6.3g，氫氧化鈉21g，溶于酒石酸鉀鈉的熱溶液(182g酒石酸鉀鈉溶于500mL熱水)中，再加5g苯酚，5g無水亞硫酸鈉，攪拌加熱溶解，冷卻后定容至1000mL，置棕色瓶內保存，7d后標定和使用;葡聚糖標準品 Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

食物調理機 德國BROWN公司;RE-52A型旋轉蒸發儀、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠; Hitachi Himac CR22g高速冷凍離心機 日本日立株式會社;S22-2磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司; DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏精密實驗設備有限公司;UV757CRT紫外可見分光光度計 普析通用;高效液相色譜儀 德國KNAUER公司;冷凍干燥機。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜多糖的提取 新鮮南瓜，-18℃緩凍24h，洗凈，切塊，打磨成漿。以料液比1∶4(w/v)加入去離子水，于85℃水浴中浸提4h，4200r/min離心15min，收集上清液，殘渣用1∶4(w/v)的去離子水在85℃水浴中再浸提3h，離心，合并兩次上清液。向上清液中加入三倍體積的無水乙醇，攪拌30min，然后在4℃冰箱靜置12h，4800r/min離心10min，分離醇沉物，凍干作為多糖樣品［8］。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 時間對南瓜總糖含量和聚合度的影響 取1g多糖于20mL 7.5%(V/V)的硫酸溶液中，在70℃下分別水解 60、120、180、240、300、360min后，用0.5mol/L的NaOH溶液中和至中性，測定還原糖與總糖含量。

1.2.2.2 溫度對南瓜總糖含量和聚合度的影響 取1g多糖于20mL 7.5%(V/V)的硫酸溶液中，分別在40、50、60、70、80℃下水解180min后，用0.5mol/L的NaOH溶液中和至中性，測定還原糖與總糖含量。

1.2.2.3 硫酸濃度對南瓜總糖含量和聚合度的影響

取1g多糖分別于20mL 2.5、5.0、7.5、10.0的12.5% (V/V)硫酸溶液中，在70℃下水解180min后，用0.5mol/L的NaOH溶液中和至中性，測定還原糖與總糖含量。

1.2.3 優化實驗設計 依據 Design Expert 7.0.0軟件，采用Central Composite Design建立數學模型，以時間X1、溫度X2和硫酸濃度X3三個因子為自變量。其中，Xi為自變量的真實值，xi為自變量的編碼值，按方程xi=(Xi-Xo)/ΔX對自變量進行編碼。Xo為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。以平均聚合度和總糖含量為響應值，建立回歸方程模型。

根據單因素實驗結果，采用三因素五水平的響應面法，實驗因子編碼及水平見表1。

表1 響應面三因素五水平實驗設計

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 總糖含量的測定［9］總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法。標準曲線的制作如下:稱取葡萄糖1.00g溶于去離子水，定容至100mL，取1mL定容至100mL，即制得100μg/mL標準葡萄糖溶液。分別移取配制的100μg/mL標準葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL于試管，以去離子水定容至1.0mL，即得不同濃度葡萄糖標準溶液(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL)，加入1.0mL的6%苯酚溶液，然后加入濃硫酸5.0mL，室溫靜置20min，以0管為空白，于490nm波長處測定其他各管溶液的吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標，以490nm吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線，其方程為Y=0.00986x-0.0392。

將多糖水解液稀釋合適的倍數，取稀釋液1.0mL，按照上述步驟操作，測定吸光值，以標準曲線方程計算總糖含量。

1.2.4.2 還原糖含量的測定［10］還原糖含量的測定采用DNS法。標準曲線的制作如下:取8支干凈的試管分別加入0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0mL的1mg/mL葡萄糖標準液、3.0mL DNS試劑，補充去離子水到4.0mL，沸水浴反應10min后，迅速放入冰水浴中冷卻，稀釋至 20.0mL，以蒸餾水做空白，在540nm處測定溶液的吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標，以540nm吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線，其方程為Y=0.8564x-0.0142。

將多糖水解液稀釋合適的倍數，取稀釋液1.0mL，按照上述步驟操作，測定吸光值，以標準曲線方程計算還原糖含量。

1.2.4.3 平均聚合度的計算［11］見下式:

平均聚合度=總糖/還原糖

1.2.4.4 軟件分析 本實驗統計分析軟件采用SPSS16.0，作圖軟件采用Origin 8.0。

2 結果與討論

2.1 不同水解程度南瓜多糖的平均聚合度

從圖1中可以看出，降解后得到的不同平均聚合度的糖樣品的分子量分布明顯不同。圖中a為未降解的南瓜多糖樣品，平均聚合度為24519;b、c、d為南瓜多糖經酸水解制備的南瓜低聚糖樣品，平均聚合度分別為4977、3374、2945。

圖1 時間對總糖含量和平均聚合度的影響

樣品a分子量主要分布于5000Da以上，最大分子量延伸到2.7×105Da;經過一定程度降解的樣品b其12000Da以上的分子量分布明顯減少，分子量在5000Da以下的產物明顯增多，其中低于麥芽糖的小分子單糖產物顯著增多;樣品c的降解程度更深，其5000Da以上的分子量分布較b明顯減少，低于麥芽糖的小分子單糖產物略為增多;樣品d的降解程度最深，其幾乎沒有高于麥芽糖以上的小分子單糖產物，樣品中主要組成物質為單糖。

所以在南瓜多糖降解過程中，用平均聚合度的變化來描述分子量的分布變化是穩定、可行的。

因此，為了充分降解南瓜多糖制備南瓜低聚糖，在高效液相色譜分析實驗的基礎上，本實驗選取平均聚合度3000作為響應值優化的目標值。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 時間對總糖含量和聚合度的影響 圖2結果表明，當反應時間為240min時，所得總糖含量最高，達到35.18mg/mL。當反應時間小于240min時，隨著反應時間的延長總糖含量逐漸增高;當反應時間大于240min時，隨著反應時間的延長總糖含量逐漸下降。在本實驗范圍內，隨著反應時間的延長，聚合度逐漸下降。

圖2 時間對總糖含量和平均聚合度的影響

2.2.2 溫度對總糖含量和聚合度的影響 圖3結果表明，當反應溫度為60℃時，所得總糖含量最高，達到37.19mg/mL。當反應溫度小于60℃時，隨著反應溫度的增加總糖含量逐漸增高;當反應溫度大于60℃時，隨著反應溫度的增加總糖含量逐漸下降。在本實驗范圍內，隨著反應溫度的延長，聚合度逐漸下降。

圖3 溫度對總糖含量與平均聚合度的影響

2.2.3 硫酸濃度對總糖含量和聚合度的影響 圖4結果表明，當硫酸濃度為7.5%時，所得總糖含量最高，達到34.6mg/mL。當硫酸濃度小于7.5%時，隨著硫酸濃度的增加，總糖含量逐漸增高;當硫酸濃度大于7.5%時，隨著硫酸濃度的增加總糖含量逐漸下降。在本實驗范圍內，隨著硫酸濃度的增加，聚合度逐漸下降。

圖4 硫酸濃度對總糖含量和平均聚合度的影響

2.3 響應面法優化南瓜低聚糖提取工藝

2.3.1 響應面法實驗設計及結果 表2中給出了總糖含量和平均聚合度的實驗結果。

表2 響應面分析實驗設計及結果

2.3.1.1 總糖含量的分析 按照Design Expert軟件中的Central Composite Design模型，對實驗設計各組的總糖含量進行回歸分析，得回歸方程如下:Y1= 33.34-0.18x1-0.46x2-0.22x3-0.17x1x2+0.24x1x3+ 0.035x2x3-0.077-0.15-1.55(Y1為總糖含量，x1、 x2、x3分別為上述3個自變量的編碼值)。該模型的相關系數是0.8335(p＜0.05)，模型的擬合度良好，該模型是合適的，可以用此模型分析和預測不同水解條件下總糖含量的變化。對模型進行回歸系數顯著性檢驗(表3)，由此可知，溫度對總糖含量的影響顯著，硫酸濃度的二次項對總糖含量的影響極顯著。依據一次項回歸系數絕對值的大小可知，因素的主效應關系為:溫度＞硫酸濃度＞時間。

表3 回歸方程模型系數的顯著性檢驗

根據模型的回歸方程，固定一個因素在編碼值0的水平，分析另外兩個因素對總糖含量的影響，Design Expert軟件生成3個三維響應面(圖5～圖7)。從圖5可以看出，硫酸濃度在7.5%時，溫度和時間對總糖含量的影響。從圖6可以看出，溫度在60℃時，時間和硫酸濃度對總糖含量的影響。從圖7可以看出，時間在240min時，溫度和硫酸濃度對總糖含量的影響。

圖5 溫度和時間對總糖含量影響的響應面

圖6 硫酸濃度和時間對總糖含量影響的響應面

圖7 溫度和硫酸濃度對總糖含量影響的響應面

2.3.1.2 平均聚合度的分析 按照Design Expert軟件中的Central Composite Design模型，對實驗設計各組的平均聚合度進行回歸分析，得回歸方程如下:Y2=3106.99-407.18x1-1797.52x2-406.01x3+140.26x1x2+73.90x1x3+204.91x2x3+74.45x+372.51x-266.67x(Y2為平均聚合度;x1、x2、x3分別為上述3個自變量的編碼值)。該模型的相關系數是0.9856 (p＜0.05)，模型的擬合度良好，該模型是合適的，可以用此模型分析和預測平均聚合度隨水解條件的變化。對模型進行回歸系數顯著性檢驗(表3)，由此可知，時間、溫度、硫酸濃度的一次項，溫度的二次項和硫酸濃度的二次項對平均聚合度的影響極顯著。依據一次項回歸系數絕對值的大小可知，因素的主效應關系為:溫度＞時間＞硫酸濃度。

根據模型的回歸方程，固定一個因素在編碼值0的水平，分析另外兩個因素對平均聚合度的影響，Design Expert軟件生成3個三維響應面(圖8～圖10)。從圖8可以看出，硫酸濃度在7.5%時，溫度和時間對總糖含量的影響。從圖9可以看出，溫度在60℃時，時間和硫酸濃度對總糖含量的影響。從圖10可以看出，時間在240min時，溫度和硫酸濃度對總糖含量的影響。

圖8 溫度和時間對平均聚合度影響的響應面

圖9 硫酸濃度和時間對平均聚合度影響的響應面

圖10 硫酸濃度和溫度對平均聚合度影響的響應面

2.3.2 優化 本實驗的目的在于保證快速、穩定地降解到適當的平均聚合度的同時獲得最高的總糖含量，以獲得高的產率與活性，因此優化方法選擇固定平均聚合度在 3000，同時取總糖含量最大。用Design Expert軟件進行優化，時間、溫度和硫酸濃度都選擇在本實驗范圍內;總糖含量的目標選擇最大，重要性選擇+++++，最低值選擇29.6227mg/mL，最高值選擇34.2475mg/mL，權重選擇1;平均聚合度的目標選擇3000，權重選擇1。

優化的結果為:時間171min，溫度64℃，硫酸濃度7.3%。在這個條件下獲得的總糖含量為33.362mg/mL，同時平均聚合度為3000。

2.3.3 驗證實驗 按實驗優化條件下進行驗證實驗(如表4)得到的總糖含量為32.192mg/mL，平均聚合度為2906，接近且都略低于Design Expert軟件分析得到的預測值。由此證明實驗模式合理，實驗結果理想。

表4 驗證實驗條件和結果

3 結論

3.1 本實驗利用 Design Expert軟件，采用 Central Composite Design建立總糖含量回歸模型:Y1=33.34 -0.18x1-0.46x2-0.22x3-0.17x1x2+0.24x1x3+ 0.035x2x3-0.077-0.15-1.55以及平均聚合度回歸模型:Y2=3106.99-407.18x1-1797.52x2-406.01x3+140.26x1x2+73.90x1x3+204.91x2x3+74.45+ 372.51-266.67，兩個方程擬合程度良好，實驗誤差小。

3.2 利用模型的響應面及其等高線對影響總糖含量和平均聚合度的關鍵因子及其相互作用進行探討，優化出了在目標平均聚合度下獲得最高總糖含量的條件為:時間171min，溫度64℃，硫酸濃度7.3%，所得到的總糖含量為 32.192mg/mL，平均聚合度為2906。

3.3 本實驗將化學法測定平均聚合度與高效液相色譜法相結合，發現該方法可以簡便、快捷、穩定地評價降解程度。

3.4 本實驗在研究如何利用南瓜果肉資源，增加南瓜附加值的基礎上，探索了利用酸降解南瓜多糖制備低聚糖的方法及可能遇到的問題，為后續研究應用其他途徑降解南瓜多糖奠定了基礎。

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Optimization of pumpkin polysaccharide hydrolysis process

DU Bing-jian，LI Quan-hong*
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University Engineering Research Centre for Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Education Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

Pumpkin is rich in resources.In this study，for the use of the pumpkin polysaccharides one of the main component of pumpkin，response surface methodology was applied to study the effect of time(x1)，temperature (x2)and acid concentration(x3)on the acidic hydrolysis of pumpkin polysaccharide oligosaccharide process on the preparation.A time of 171min，temperature of 64℃;sulfuric acid concentration of 7.3%were thought to be optimal.These conditions resulted in a total sugar concentration of 33.362mg/mL，while the average degree of polymerization of 3000，as a result to the protection of polysaccharide content of pumpkin polysaccharide while achieving the purpose of controllable degradation.These results help in the deep processing and utilization of pumpkin，and increasing the added value by a new way.

pumpkin;polysaccharide;acidic hydrolysis;response surface

TS255.1

B

1002-0306(2011)03-0232-05

南瓜屬于葫蘆科南瓜屬，發源于北美洲，在世界各地都有種植，亞洲種植面積最多［1］。我國每年利用南瓜籽數千噸，但對南瓜果肉資源利用十分有限。南瓜籽與果肉部分(扣除皮、瓤)質量比為1∶30～1∶45，果肉部分作為粉劑或者廉價飼料利用不到30%，有近70%因得不到有效利用而被棄掉，造成了浪費與污染［2］。南瓜的含水量接近90%，碳水化合物含量占干物質2/3，其中以大分子的南瓜多糖為主，分子量從數萬到數百萬道爾頓不等，單糖組成包括半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖等。南瓜多糖聚合度高、分子空間體積大、生物利用度低，極大地限制了南瓜多糖在食品、醫藥和化工等產業的應用［3］。低聚糖具有多種生物活性，在日本、歐洲以及美國擁有巨大的市場［4-7］。通過可控的酸降解南瓜多糖，生產南瓜低聚糖，將有效推進南瓜肉質資源的開發利用，實現南瓜農產品的深加工，增加其附加值。為了能高效的制備南瓜低聚糖，本文在單因素實驗的基礎上，運用響應面法研究了硫酸濃度、時間、溫度對總糖含量和平均聚合度的影響及交互作用，優化了南瓜多糖酸水解的工藝。

2010-03-03 *通訊聯系人

杜秉健(1985-)，男，在讀碩士，主要從事天然產物提取與開發的研究。

國家自然科學基金面上項目(30972047)。