豆豉中乙酰膽堿酯酶抑制劑的提取與富集工藝研究

宋 慶，張赟彬

(1.上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234; 2.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海200235)

豆豉中乙酰膽堿酯酶抑制劑的提取與富集工藝研究

宋 慶1，張赟彬2，*

(1.上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234; 2.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海200235)

研究單因素實驗優化豆豉中乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑的提取工藝。粗提液依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并對石油醚萃取相選用七種不同型號的大孔吸附樹脂富集，通過Ellman法對豆豉提取物體外AchE抑制能力進行測定。結果表明，最佳提取工藝為:提取時間60min，乙醇濃度80%，溫度70℃，固液比1∶10時，1.0mg/mL的豆豉提取液對AchE的抑制率為52.33%;各有機溶劑的萃取組分在1.0mg/mL時的AchE抑制率分別為:石油醚組分75.52%、二氯甲烷組分61.00%，乙酸乙酯組分70.84%和正丁醇組分26.73%;HZ-801型大孔樹脂具有較好的吸附性能，最佳富集工藝為:靜態吸附3.0h，吸附飽和的樹脂以80%乙醇動態洗脫，洗脫流速1.0mL/min，富集后的洗脫液對AchE抑制率達83.67%。

豆豉，萃取，乙酰膽堿酯酶抑制劑，大孔吸附樹脂

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉 購于徐匯區漕河涇菜場，產地為重慶永川;無水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 國藥集團，分析純;乙酰膽堿酯酶(AchE)、硫代乙酰膽堿(ATch)、二硫二硝基苯甲酸(DTNB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)sigma公司。

DJ靈巧型粉碎機 上海淀久中藥器械制造有限公司;754紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;冷凍真空干燥機上海照生有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙酰膽堿酯酶抑制劑的測定方法的建立

1.2.1.1 實驗原理 根據Ellman的方法［5］，底物硫代乙酰膽堿(ATch)在乙酰膽堿酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代膽堿(Thiocholine)，硫代膽堿與顯色劑DTNB迅速作用，生成在412nm處有光吸收的黃色物質，在酶催反應的穩態階段，其OD值即可代表起始反應速率。

1.2.1.2 豆豉提取液中AchE抑制率的測定［6］在試管中加入2900μL的PBS，20μL 1.0U/mL的乙酰膽堿酯酶和100μL稀釋到一定濃度的豆豉提取物，37℃預熱 10min，然后依次加入 15mmol/L的 DTNB 50μL，15mmol/L的 ATch 50μL，37℃ 水浴反應20min，加入1.0mL的4%SDS終止反應，迅速測其412nm的OD值，記為A樣品，每個樣品作3個平行，取平均值。由于豆豉提取物多有顏色，所以每次實驗同時做一個本底扣除，即用20μL PBS代替乙酰膽堿酯酶，記為A本底;因豆豉提取物用10%乙醇溶液溶解，可能乙醇溶液本身就會導致乙酰膽堿酯酶失活，所以以10%乙醇代替提取物作為對照，記為A對照;再做空白對照組，即用100μL PBS代替豆豉提取物，記為A空白。

抑制率的計算公式:

1.2.2 豆豉提取液的制備

1.2.2.1 樣品的預處理 豆豉真空干燥后，用粉碎機粉碎，過60目篩，密封保存備用。

1.2.2.2 豆豉不同溶劑提取液的制備 在3個錐形瓶中分別裝入10.0g凍干豆豉粉末，分別加入水、甲醇和無水乙醇100mL，在30℃下振蕩(120r/min)提取2h。將提取液于4000r/min離心20min，上清液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，冷凍真空干燥后4℃保存備用，樣品用100mmol/L pH 8.0的PBS稀釋至一定濃度梯度。

1.2.2.3 豆豉不同時間提取液的制備 在8個錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，然后分別加入無水乙醇100mL，在30℃下分別振蕩(120r/min)提取15、30、45、60、120和240min。后處理同1.2.2.2。

1.2.2.4 豆豉不同固液比提取液的制備 在4個錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，分別加入無水乙醇50、100、150和200mL，在30℃下振蕩(120r/min)提取60min，后處理同1.2.2.2。

1.2.2.5 豆豉不同乙醇濃度提取液的制備 在4個錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，然后分別加入40%、60%、80%和100%(體積比)的乙醇水溶液100mL，后處理同1.2.2.2。

1.2.2.6 豆豉不同溫度提取液的制備 在5個錐形瓶中分別裝入10.0g豆豉粉末，然后分別加入80%的乙醇水溶液100mL，分別在30、50、70和90℃的溫度下提取60min，后處理同1.2.2.2。

1.2.2.7 豆豉粗提液的萃取處理 稱取豆豉粉末100.0g，按照優化的提取工藝制備粗提液，將粗提液減壓濃縮，得到的浸膏依次用石油醚(100×3)、二氯甲烷(100×3)、乙酸乙酯(100×3)和正丁醇(100× 3)萃取，合并各萃取液。將各萃取液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏后冷凍真空干燥至粉末，然后用10%乙醇將各組分稀釋成1.0mg/mL溶液。按照1.2.1.2測定各萃取組分對乙酰膽堿酯酶的抑制率。

1.2.3 大孔樹脂富集豆豉提取液中乙酰膽堿酯酶抑制劑

1.2.3.1 大孔樹脂的選擇 分別取預處理過的D3520、NKA-Ⅱ、H103、NKA-9、ADS-7、HZ-801和HZ-818型大孔樹脂各1.0g于錐形瓶中，加入上樣液50mL，置于搖床中振蕩過夜(20℃，120r/min)，過濾，測定濾液中乙酰膽堿酯酶抑制劑的濃度;選擇吸附效果較好的大孔樹脂，待其吸附飽和后過濾，樹脂用去離子水清洗，然后放回錐形瓶中，加入80%的乙醇50mL，置于搖床中振蕩過夜(20℃，120r/min)，過濾，測定洗脫液中乙酰膽堿酯酶抑制劑的濃度。按下式計算大孔樹脂對乙酰膽堿酯酶的吸附率與解吸率:

式中:I前，I后分別為吸附前后上樣液對乙酰膽堿酯酶的抑制率;I解為解吸液對乙酰膽堿酯酶的抑制率。

1.2.3.2 HZ-801大孔樹脂靜態吸附動力學曲線 稱取處理好的HZ-801大孔樹脂3份，每份1.0g，于150mL的錐形瓶中，加入上樣液50mL，置于搖床中振蕩，每30min從溶液中取樣，測定溶液對乙酰膽堿酯酶的抑制率。

1.2.3.3 乙醇濃度對解吸的影響 取吸附飽和的HZ-801大孔樹脂5份，每份1.0g，于150mL的錐形瓶中，用濃度為60%、70%、80%、90%和100%的乙醇進行解吸，解吸完全后，測定相關溶液對乙酰膽堿酯酶的抑制率，計算出解吸率。

1.2.3.4 大孔樹脂的動態解吸 將吸附飽和的HZ-801大孔樹脂100.0g裝入層析柱中，然后以80%乙醇溶液以0.5、1.0、1.5、2.0mL/min的流速洗脫，確定最佳流速。解吸液每50mL為一流分，并測定每個流分對乙酰膽堿酯酶的抑制率。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

2.1.1 不同溶劑的豆豉提取液對AchE的抑制率

結果表明，用乙醇作為豆豉的提取溶劑，提取液濃度在1.0mg/mL時對AchE的抑制率較高，而水提液對AchE的抑制率很低，可以粗略地判斷提取液中有效成分為弱極性或者非極性物質，因此選擇乙醇作為提取溶劑。

表1 不同溶劑的豆豉提取液對AchE的抑制率(1.0mg/mL)

2.1.2 不同時間的豆豉提取液對AchE抑制率的影響 實驗表明，在60min前，提取物中乙酰膽堿酯酶抑制物的含量隨著提取時間的延長逐步增加，60min后，提取物對AchE抑制率逐漸下降，可能是隨著提取時間增加，提取液中非AchE抑制成分的含量增多，導致提取物濃度在1.0mg/mL時的有效成分相對含量降低，綜合考慮，確定最佳提取時間為60min。

圖1 不同時間的豆豉提取液對AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

2.1.3 不同固液比的豆豉提取液對AchE抑制率的影響 實驗表明，在固液比大于1∶10時，豆豉提取液對AchE抑制率基本保持不變，考慮到提取操作的經濟性，確定固液比為1∶10時可以有效地提取豆豉中有效活性物質。

圖2 不同固液比的豆豉提取液對AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

2.1.4 不同乙醇濃度的豆豉提取液對AchE抑制率的影響 實驗表明，隨著乙醇濃度的變化，提取液對AchE抑制率變化有一個先上升后下降的趨勢;在乙醇濃度為80%時，豆豉提取液對AchE抑制率最高。乙醇水溶液作為提取溶劑，其中，水的存在能幫助滲透豆豉組織，提高滲透性，更易于有效成分溶于溶劑體系中，從而游離到胞外。80%的乙醇對豆豉中AchE抑制成分的提取效果較好。

圖3 不同乙醇濃度的豆豉提取液對AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

2.1.5 不同溫度下的豆豉提取液對AchE抑制率的影響 實驗表明，隨著溫度升高，豆豉提取液對乙酰膽堿酯酶抑制劑的濃度逐漸增加，說明豆豉中的AchE抑制成分熱穩定性較好，因此確定提取最適溫度為70℃。

圖4 不同溫度下的豆豉提取液對AchE抑制率的影響(1.0mg/mL)

以上實驗結果表明，通過對提取溶劑、提取時間、固液比、乙醇濃度、提取溫度等單因素實驗，確定提取工藝為:浸提時間為60min，固液比為1∶10，乙醇濃度為80%，溫度為70℃;該提取工藝更易于豆豉中AchE抑制成分的提取，在該工藝條件下，濃度為1.0mg/mL的豆豉提取液對AchE抑制率為52.33%。

2.1.6 各有機溶劑萃取組分對AchE的抑制率 實驗結果表明，前三種萃取組分對AchE的抑制率都較強，其中以石油醚萃取相活性最高，其具體的化學成分還有待進一步分析。已有的文獻報道表明［7］，脂肪酸，甘油酯，長鏈烴類化合物，極性小、含氧取代低的萜類、甾體，生物堿等是石油醚萃取相中的主要組成成分，并且已有多種生物堿類和萜類被報道具有AchE抑制活力，后續實驗將重點對石油醚萃取相進行富集和進一步分離純化。

表2 各有機溶劑萃取組分對AchE的抑制率(1.0mg/mL)

2.2 大孔樹脂對石油醚相中乙酰膽堿酯酶抑制劑的富集

2.2.1 靜態吸附法篩選大孔樹脂 選擇極性不同的7種大孔樹脂對石油醚相中乙酰膽堿酯酶抑制劑富集，綜合吸附率與解吸率篩選性能較好的樹脂，實驗結果表明，HZ-801對石油醚相中的AchE抑制劑的靜態吸附及解吸性能都較好，優于其他幾種樹脂，是富集乙酰膽堿酯酶抑制劑較理想的吸附劑。

表3 不同吸附樹脂對AchE抑制劑的吸附率和解吸率

2.2.2 HZ-801大孔樹脂靜態吸附動力學曲線 樹脂對石油醚相中乙酰膽堿酯酶抑制劑的吸附特性不僅表現在吸附量和選擇性上，其吸附速度也是重要的影響因素。實驗結果表明，乙酰膽堿酯酶抑制劑在HZ-801大孔樹脂上經過3.0h后基本達到吸附平衡，平衡時的吸附率為85.44%，因此在以后的實驗中應使吸附時間大于3.0h，以確保吸附平衡。

圖5 靜態吸附動力學曲線

2.2.3 乙醇濃度對解吸性能的影響 實驗表明，隨著乙醇濃度的升高，解吸率也隨之升高，當乙醇濃度達到80%以上后，解吸率上升緩慢，考慮到乙醇的用量，做到降低富集的成本，確定用80%的乙醇作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的解吸液，解析率為88.12%，解吸液對AchE抑制率為81.89%。

圖6 乙醇濃度對解吸的影響

2.2.4 流速對解吸性能的影響 實驗結果表明，以80%的乙醇溶液為洗脫液，解吸率隨流速的增高而降低，以0.5mL/min和1.0mL/min洗脫時，洗脫效果較好，考慮到實驗效率，因此選用1.0mL/min的流速進行洗脫為宜，解析率達到91.03%，解吸液對AchE抑制率達83.67%。相對靜態解吸有明顯提高，見圖7。

2.2.5 動態解吸曲線 實驗結果表明，乙醇溶液以1.0mL/min洗脫時，乙酰膽堿酯酶抑制劑迅速被洗脫下來，洗脫液通過500mL后，吸附在樹脂上的乙酰膽堿酯酶抑制劑基本洗脫下來，解吸曲線出峰快，且無明顯拖尾現象。詳見圖8。

3 結論

3.1 用不同溶劑(水、甲醇、乙醇)提取豆豉，乙醇提取物對AchE的抑制率最高。

圖7 不同流速對解吸的影響

圖8 動態解吸曲線

3.2 提取時間、固液比、乙醇濃度、提取溫度對豆豉中AchE抑制成分的提取都存在影響，最佳提取工藝為:浸提時間為60min，固液比為1∶10，乙醇濃度為80%，溫度為70℃;濃度為1.0mg/mL的豆豉提取液對AchE抑制率最高為52.33%。

3.3 粗提液經下述有機溶劑進一步萃取，石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯組分對AchE抑制率較強，分別為: 75.52%、61.00%、70.84%;正丁醇組分對AchE抑制率較弱為:26.73%。

3.4 通過篩選大孔樹脂對石油醚相中的乙酰膽堿酯酶抑制劑進行富集，綜合吸附性能與解吸性能，選擇HZ-801大孔樹脂富集乙酰膽堿酯酶抑制劑。HZ-801大孔樹脂3.0h后吸附飽和，其動態解吸性能比靜態解吸性能好。吸附飽和的樹脂以80%乙醇、1.0mL/min洗脫時，解吸率達到91.03%，洗脫液對AchE抑制率達83.67%。解吸曲線出峰快，且無明顯拖尾現象。

［1］李前，朱振霞，孫曼霽.乙酰膽堿酯酶與老年性癡呆關系的研究進展［J］.中國老年學雜志，2002，22(4):325-326.

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［4］管立軍，程永強，李里特.腐乳和豆豉功能性研究進展［J］.中國實物與營養，2008(11):48-51.

［5］Ellman G L，Courtney K D，Andres V Jr，et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity［J］.Biochem Pharmacol，1961，7:88-95.

［6］張翼，馮妍，李曉明，等.海藻組分抑制乙酰膽堿酯酶活性研究［J］.海洋與湖沼，2005，36(5):459-463.

［7］Faulkner D J.Marine natural products［J］.Natural Product Reports，2001，18(1):1-49.

Extraction and enrichment technique of acetylcholinesterase inhibitor from Douchi

SONG Qing1，ZHANG Yun-bin2，*
(1.College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China; 2.School of Perfume and Aroma Technology，Shanghai Institute of Technology，Shanghai 200235，China)

Extraction of acetylcholinesterase(AchE)inhibitor from Douchi was optimized through single factor experiment.Crude extract was extracted by petroleum ether，methylene chloride，ethyl acetate and n-butanol extract in turn，and the petroleum ether fraction was enriched with macroporous resin.Ellman’s method was used to determine AchE inhibitory activity in vitro.The results showed that the optimum extraction condition were with the extract time of 60min，ethanol concentration of 80%，extraction temperature of 70℃，ratio of liquid/solid of 1∶10. 1.0mg/mL of Douchi extract showed 52.33%AchE inhibition rate.Crude Douchi extract was further extracted.The AchE inhibition rate of 1.0mg/mL extract by following solvent was as follows:75.52%by petroleum ether，61.00%by methylene chloride，70.84%by ethyl acetate and 26.73%by n-butanol.HZ-801 macroporous resin was selected to enrich acetylcholinesterase inhibitor.The optimum enrichment conditions were absorbed time of 3.0h，elution solvent of 80%ethanol，and 1.0mL/min elution rate.After enrichment，the AchE inhibition rate could reach 83.67%.

Douchi;extract;acetylcholinesterase inhibitor;macroporous resin

TS214.9

B

1002-0306(2011)03-0285-04

乙酰膽堿酯酶(acetylchlinesterase，AchE)是老年癡呆疾病阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)的一個酶抑制劑作用靶點，AchE催化乙酰膽堿的裂解反應，導致乙酰膽堿的缺失，直接造成神經信號傳遞失敗，引起老年癡呆癥［1］。如今，隨著人口老齡化速度的快速增加，AD病人日益增多，已經成為繼心血管疾病和腫瘤之后嚴重威脅老年人生命健康的主要疾病之一。據預測，我國在21世紀中葉，60歲以上的老齡人口將達到4億左右，并將成為世界上老年人口最多的國家［2］。而應用于臨床的AchE抑制劑大多存在半衰期短、較嚴重的外周膽堿能系統副作用等缺點，不利于患者長期服用［3］。所以從大自然中開發、尋找具有適宜患者長期服用、毒副作用小、作用面廣等優點的AchE抑制劑受到科學研究者們的廣泛關注。豆豉作為中國的一種傳統大豆發酵食品在南方地區深受老百姓的喜愛，它的營養價值極高。制作及食用豆豉在我國已有上千年歷史。豆豉具有較好的生理功能，已見報道的有預防糖尿病、抗氧化、降血壓、溶血栓、抗老年癡呆等作用［4］。本文探討了豆豉中AchE抑制劑的提取以及大孔樹脂對其富集工藝研究，為開發新型、適宜患者長期服用、毒副作用小的治療老年癡呆癥的藥物打下基礎。

2010-03-09 *通訊聯系人

宋慶(1984-)，男，碩士研究生，研究方向:天然產物化學。

上海市自然科學基金項目(08CR1418900)。