好氧反硝化細菌WIT－1的分離鑒定及其脫氨氮特性

（1.武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室，湖北武漢 430074；

2.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009）

好氧反硝化細菌WIT－1的分離鑒定及其脫氨氮特性

（1.武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北省新型反應器與綠色化學工藝重點實驗室，湖北武漢 430074；

2.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009）

為了選擇和研究一種好氧反硝化細菌，從武漢工程大學苗圃分離到一株具有好氧反硝化能力的細菌并命名為WIT－1，鑒定為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落為淡黃色，結合16S rDNA序列分析結果初步鑒定菌株WIT－1為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）.初步探討了菌株WIT－1在不同碳源種類、碳氮比、p H值、溫度對菌株WIT－1脫氨氮作用的影響.結果表明，該菌去除氨氮過程中同時也能降低化學需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD），并且不積累硝酸鹽和亞硝酸鹽.不同碳源種類下菌株WIT－1的脫氨氮能力從高到低順序為：丁二酸鈉、乙酸鈉、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸三鈉.除氨氮和COD的最適初始p H為7.5，最適溫度為30℃.菌株WIT－1在最適條件下，24 h對氨氮的降解率可以達到100%，48 h對COD的降解率為73.44%.

好氧反硝化；異養硝化；施氏假單胞菌；氨氮

0 引 言

據《2010年環境狀況公報》顯示，我國環境總體形勢依然十分嚴峻.湖泊（水庫）富營養化問題依然突出，在監測營養狀態的26個湖泊（水庫）中，富營養化狀態的占42.3%.水體的富營養化問題主要由水體中的總氮超標所引起.由于氮元素污染的危害，脫氮已經成為水處理和防止氮素危害的重要一步.目前普遍認為，生物脫氮是水處理中防止氮素危害最經濟有效的方法之一.傳統生物脫氮途徑一般包括硝化和反硝化兩個步驟，即在好氧條件下通過自養硝化菌的作用，將水中氨氮（NH4＋－N）轉化為硝酸氮（NO－3－N）或亞硝酸氮（NO－2－N），然后在缺氧或厭氧條件下，利用反硝化菌將硝酸氮和亞硝酸氮還原為氮氣，達到脫氮的目的［1］.由于兩個菌的作用條件不同，這兩個過程不能同時發生，只能序列進行［2］.近些年來，不斷有好氧反硝化細菌的分離報道，好氧反硝化現象的出現突破了傳統理論的束縛，使人們對生物脫氮技術的發展有了全新的認識.已有文獻［3］報道一些好氧反硝化細菌同時具有異養硝化功能，這一發現為同時硝化反硝化工藝（simultaneous nitrification denitrification，SND）發展奠定了理論基礎［4］.因此異養硝化－好氧反硝化菌正成為研究的熱點.文獻報道的許多菌屬如Pseudomonas stutzeri，Thiosphaera pantotropha，Alcaligenes faecalis，Pseudomonas putida等［5－7］都具有良好的異養硝化－好氧反硝化作用.筆者從武漢工程大學苗圃采集土樣，通過富集分離到一株具有好氧反硝化能力的細菌，該菌株命名為WIT－1.通過形態觀察和16S rDNA序列分析，對菌株WIT－1進行初步鑒定.初步探討了不同碳源種類、碳氮比、p H值、溫度對菌株WIT－1脫氨氮作用的影響.為后面的實現同時硝化反硝化工藝做前期的理論研究.

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 好氧反硝化細菌WIT－1為本實驗室從武漢工程大學苗圃采集土樣中分離.

1.1.2 培養基 反硝化細菌富集分離培養基［8］成分（g／L）：Na2HPO4·7H2O為7.9；KH2PO4為1.5；NH4Cl為0.3；MgSO4·7 H2O為0.1；丁二酸鈉為4.7；KNO3為2；NaNO2為0.5.微量元素溶液2 m L.

微量元素溶液成分（g／L）：EDTA為50.0；ZnSO4為2.2；CaCl2為5.5；MnCl2·4H2O為5.06；FeSO4·7 H2O為5.0；CuSO4·5H2O為1.57；CoCl2·6H2O為1.61.p H為7.0～7.5.

反硝化測定培養基：不添加KNO3和NH4Cl，初始亞硝酸氮質量濃度為100 mg／L，其它與反硝化細菌富集分離培養基基本一致.

脫氨氮測定培養基：不添加 KNO3和Na NO2，（NH4）2SO4代替NH4Cl，（NH4）2SO4和丁二酸鈉含量隨實驗內容而變，其它與反硝化細菌富集分離培養基基本一致.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的富集分離純化 稱取1 g土樣接種到裝有四粒玻璃珠和100 m L滅菌的反硝化細菌富集分離培養基的250 m L錐形瓶中，錐形瓶用九層紗布封口，在30℃、180 r／min的搖床中振蕩48 h.經過四次重復的富集后，取0.5 m L進行10倍梯度稀釋到10－7，從10－5到10－7分別取100 u L進行平板涂布于30℃電熱恒穩培養箱培養48 h.通過四次平板劃線得到三株純化的菌株，分別命名為WIT－1、WIT－2和WIT－3.

1.2.2 好氧反硝化菌株脫NO2－－N的測定 在3個裝有100 m L反硝化測定培養基的250 m L錐形瓶中，以體積分數30%的接種量分別加入富集擴大培養后的菌液WIT－1、WIT－2和WIT－3，錐形瓶置于30℃、180 r／min的搖床上振蕩培養，每隔2 h取1次樣測定亞硝酸鹽氮的濃度，并計算亞硝酸鹽氮的減少量及去除率，以時效比指標選擇優勢菌株［9］.用格利斯試劑定性測定去除亞硝酸鹽氮過程中是否有硝態氮產生.

1.2.3 供試菌株的形態觀察 細菌形態觀察根據《微生物學實驗》進行鑒定［10］.

1.2.4 16S r DNA序列分析 用于16S r DNA PCR反應的通用引物是27F和1492R，其中27F為5＇－GAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇，1492R為5＇－CGGTTACCTTGTTACGACTT－3＇，都由南京金斯瑞生物科技公司合成.測序也由南京金斯瑞生物科技公司完成.將16S r DNA所測序列通過BLAST檢索程序與GenBank中已知16S r DNA序列進行比對分析.

1.3 供試菌株的脫氨氮特性的研究

1.3.1 供試菌株在不同的COD濃度下脫氨氮過程的測定 以丁二酸鈉為碳源，分別配制COD為500 mg／L，1 000 mg／L，2 000 mg／L，氨氮為90 mg／L的培養基.250 m L錐形瓶分裝100 m L培養液，接種擴大培養后的供試菌株菌液2%（v／v），置于30℃、180 r／min的搖床上振蕩培養.分別在培養0、6、12、24、48 h取樣，用Sigma離心機離心5 min，轉速8 000 r／min，取上清液測定其COD和氨氮含量.

1.3.2 供試菌株脫氨氮最適碳源種類試驗分別以葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、檸檬酸三鈉、丁二酸鈉為碳源，配制C／N質量比為2∶1，氨氮為100 mg／L的培養基.250 m L錐形瓶裝液量、接種量、培養條件、離心參數等同1.3.1，在培養12 h和24 h測定其氨氮的去除率.

1.3.3 供試菌株脫氨氮最適溫度試驗 以丁二酸鈉為碳源，配制COD為500 mg／L、氨氮為100 mg／L的培養基.250 m L錐形瓶裝液量、接種量、離心參數等同1.3.1，培養溫度分別設定為20、25、30、35、37°C，搖床轉速為180 r／min，在分別培養12和24 h測定其氨氮的去除率，48 h測定其COD去除率.

1.3.4 供試菌株脫氨氮最適p H試驗 培養溫度為30℃，初始p H分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他試驗設計同1.3.3.

1.3.5 供試菌株對氨氮質量濃度的耐受性試驗

以丁二酸鈉為碳源，配制COD為500 mg／L，初始氨氮質量濃度分別為100、200、300、400、500、600、800、1 600、2 000 mg／L的培養基.250 m L錐形瓶裝液量、接種量、培養條件、離心參數等同1.3.1，在培養24 h測定其氨氮的去除率.

1.4 檢測方法

NH4＋－N：納氏試劑光度法［11］；

NO－2－N：N－（1－萘基）－乙二胺光度法［11］；

COD：重鉻酸鉀法［11］；

定性NO－3－N：格利斯試劑［12］.

2 結果與討論

2.1 好氧反硝化菌株脫NO－2－N的測定

由圖1可知，在一定時間內，菌株WIT－1和WIT－2對亞硝酸鹽氮有很好且較為穩定的去除效果.在去除亞硝酸鹽氮過程中，經格利斯試劑定性測定WIT－1、WIT－2和WIT－3無硝態氮產生.可以判斷菌株WIT－1、WIT－2和WIT－3為好氧反硝化菌株.比較WIT－1、WIT－2和WIT－3三條曲線，經計算菌株WIT－1、WIT－2和WIT－3在4 h對NO－2－N的去除率分別為99.995%、99.958%、33.082%，在10 h內菌株WIT－3對NO－N的去除率為99.999%.以時效比指標選擇去除亞硝酸鹽氮高優勢菌株，菌株WIT－1能在短時間內去除亞硝酸鹽氮.其次是菌株WIT－2和WIT－3.選擇菌株WIT－1為進一步試驗的供試菌株.

圖1 好氧反硝化菌株的NO－N的降解曲線Fig.1 Degradation curves of nitrite nitrogen of aerobic denitrification strain注：圖中數據為3次重復試驗結果的平均值，以下同.

2.2 菌株WIT－1形態觀察和16S r DNA序列分析

通過形態觀察，菌株WIT－1為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落為淡黃色，經16S r DNA序列分析，菌株WIT－1序列全長1 395 bp，其16S r DNA基因序列與Pseudomonas stutzeri親緣關系最為接近，相似性達99%，初步鑒定菌株WIT－1為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）.

2.3 菌株WIT－1的脫氨氮特性

2.3.1 菌株WIT－1在不同的COD濃度下脫氨氮過程的測定 菌株WIT－1在不同的COD質量濃度下脫氨氮過程的試驗結果如圖2（a）、2（b）、和2（c）.從圖可知，去除氨氮過程中同時也能降低COD，且COD的降解率為62.48%～95.34%.整個過程用N－（1－萘基）－乙二胺法和格利斯試劑定性檢測，無NO－N、NO2－－N的積累.比較圖2（a）、2（b）和2（c）發現，菌株WIT－1對氨氮降解趨勢一致，12 h能達到97.37%左右，之后的24、48 h氨氮維持平衡.由實驗結果可知，對氨氮測定時間是12 h和24 h，而對COD測定時間為48 h.考慮到經濟因素和現實生活污水的COD為200～600 mg／L，所以對起始COD含量設定為500 mg／L.

2.3.2 菌株WIT－1脫氨氮最適碳源種類試驗

菌株WIT－1脫氨氮最適碳源種類試驗，發現菌株WIT－1能夠利用多種碳源進行脫氨氮.由圖3可知，在12 h以丁二酸鈉為碳源其對氨氮的去除率最高為34.12%.在24 h分別以蔗糖、乙酸鈉、丁二酸鈉為碳源其對氨氮的去除率都達到了100%.所以，丁二酸鈉為菌株WIT－1的最適碳源.王弘宇［13］等報道的兩株異養硝化細菌利用丁二酸鈉為碳源對氮素有較高的去除率.

圖2 菌株WIT－1不同初始COD條件下去除氨氮和COD測定Fig.2 Determination of strain WIT－1 removing ammonia and COD under different initial COD

圖3 菌株WIT－1不同碳源條件下去除氨氮的測定Fig.3 Determination of strain WIT－1 removing ammonia under different carbon sources

2.3.3 菌株WIT－1脫氨氮最適溫度 在不同的溫度條件脫氨氮的試驗表明，菌株WIT－1在25～37℃之間時，能夠最大程度地去除氨氮，24 h氨氮的去除率在97%左右.WIT－1在20℃時，雖然能夠最大程度地去除 COD，其去除率為82.99%，但是其24 h氨氮的去除率只有64.7%.說明低溫不利于菌株WIT－1脫氨氮.在30℃時，其去除COD的能力高于25、35和37℃，COD去除率為70.73%.綜合考慮菌株脫氨氮同時去除COD的能力，菌株WIT－1的最適溫度為30℃.這與文獻［6］報道的Alcaligenes faecalis菌株的最適反應溫度一致.

圖4 菌株WIT－1不同溫度條件下去除氨氮和COD的測定Fig.4 Determination of strain WIT－1 removing ammonia and COD under different temperatures

2.3.4 菌株WIT－1脫氨氮最適p H值 在不同初始p H值條件下脫氨氮的試驗表明，菌株WIT－1在p H值為7.0～7.5之間時，能夠最大程度地去除氨氮，24 h氨氮的去除率在100%.這說明該菌株在脫氨氮時適應于中性略偏堿性的環境.菌株WIT－1在p H值為6.5時，雖然能夠最大程度地去除COD，其去除率為89.98%，但是其24 h氨氮的去除率只有76.55%.綜合考慮菌株脫氨氮同時去除COD的能力，菌株WIT－1的最適p H值為7.5.這與文獻［14］報道的具有異養硝化功能的惡臭假單胞菌脫氨氮最適p H值相近.

圖5 菌株WIT－1在不同p H條件下去除氨氮和COD的測定Fig.5 Determination of strain WIT－1 removing ammonia and COD under different p Hs

2.3.5 菌株WIT－1對氨氮濃度的耐受性試驗不同初始氨氮條件下菌株WIT－1去除氨氮試驗結果表明，隨著初始氨氮濃度的增加氨氮除去率在下降.當初始氨氮的含量小于800 mg／L時，其對氨氮的降解率為18.5%～97.67%，相應的去除量為54.33～179 mg／L.當初始氨氮的含量2 000 mg／L時，其對氨氮的降解率為0.這有可能是C／N的質量比引起其菌株WIT－1對氨氮濃度的耐受性降低.

圖6 菌株WIT－1不同初始氨氮條件下去除氨氮的影響Fig.6 Effect of strain WIT－1 removing ammonia under different initial ammonia

3 結 語

a.菌株WIT－1是一株好氧反硝化細菌，同時也是異養硝化細菌.

b.菌株WIT－1為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落為淡黃色，初步鑒定菌株WIT－1為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）.

c.菌株WIT－1能在去除氨氮過程中同時也能降低化學需氧量.

d.菌株WIT－1不同碳源種類下菌株的脫氨氮能力大小排列為：丁二酸鈉＞乙酸鈉＞蔗糖＞葡萄糖＞檸檬酸三鈉.

e.菌株WIT－1除氨氮和COD的最適初始p H為7.5，最適溫度為30℃.在最適條件下，24 h對氨氮的降解率可以達到100%，48 h對COD的降解率為73.44%.

f.菌株WIT－1對氨氮的耐受性為2 000 mg／L.

雖然已分離得到較好的一株異養硝化－好氧反硝化細菌WIT－1，但其硝化與反硝化作用機理，以及其作用過程中的酶的影響和如何用菌株WIT－1構建SND反應，還需要進一步的探討和研究.

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Identification and characteristics of aerobic denitrification strain WIT－1

ZHANG Kai1，LEI Meng－jie1，HU Guo－yuan1，YUAN Jun1，YANG Yang1，ZHANG Jian－guo2

（1.Hubei Key Lab of Novel Reactor ＆Green Chemical Technology，Key Lab for Green Chemical Process of Ministry of Education，School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；

2.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

A aerobic denitrification strain was isolated from soil of nursery garden of Wuhan Institute of Technology，named as WIT－1.The strain WIT－1 was Gram negative，belonging to Bacillus，blond of bacterical colony.The result of 16S r DNA sequences showed that the strain WIT－1 was firstly identified as Pseudomonas stutzeri.The effects of different carbon sources，C／N，p H and temperature on the strain WIT－1 were detected.The results showed that the strain WIT－1 has the capability of removing ammonia and COD synchronously without accumulation of nitrate or nitrite.The comparison results of the ability to remove ammonia of the strain WIT－1 by different carbon sources showed in descending order as follow：sodium succinate，sodium acetate，sucrose，glucose，trisodium citrate.The optimum conditions for the strain WIT－1 of removing ammonia and COD were p H 7.5 and 30℃.In the optimum conditions，the removal rate of ammonia was 100%in 24 h，and the removal rate of COD was 73.44%in 48 h.

aerobic denitrification；heterotrophic nitrification；Pseudomonas stutzeri；ammonia

張 瑞

Q939.9

A

10.3969／j.issn.1674－2869.2011.11.004

1674－2869（2011）11－0014－05

2011－09－30

湖北省新型反應器與綠色工藝重點實驗室開放基金（RGCT201101）

張 凱（1985－），男，湖北武漢人，碩士研究生.研究方向：應用化學.

指導老師：胡國元，男，教授，博士，碩士研究生導師.研究方向：環境微生物.＊通信聯系人