重組木聚糖酶的安全高效表達與應用研究

暴立娟，宋慶鳳，李 杰

（東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150030）

重組木聚糖酶的安全高效表達與應用研究

暴立娟，宋慶鳳，李 杰*

（東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150030）

以pPIC9為載體能夠實現里氏木霉木聚糖酶基因（xyn2）在巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）中的高效表達，但是卻需要甲醇誘導，從而限制其在食品加工等領域的應用。本研究以畢赤酵母組成型啟動子——GAP啟動子替換pPIC9上的甲醇誘導型啟動子AOX，成功地表達了木聚糖酶。在此基礎上以經密碼子優化后的INU信號肽替換載體上原有的α-Factor信號肽，同時根據已發表的基因序列和AOX1基因的氨基酸序列，按照畢赤酵母的酵母偏愛密碼子，對畢赤酵母表達載體pPIC9上的α信號肽序列進行改造，結果表明，兩種信號肽均能夠引導木聚糖酶的分泌。通過添加0.01%的Triton，可以有效增強細胞膜的通透性，提高外源蛋白的分泌能力。薄層層析結果表明，木聚糖酶的酶解產物為木二糖和木三糖為主的低聚木糖及少量的木糖。

木聚糖酶，GAP啟動子，INU信號肽，α信號肽，低聚木糖

木聚糖是主要由吡喃木糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的多聚糖，是半纖維素的主要成分，廣泛存在于植物細胞壁中，是自然界中含量僅次于纖維素的可再生資源［1］。木聚糖酶（1，4-β-D-xylan xylanohydrlase，EC 3.2.1.8）通過內切方式水解木聚糖分子中的β-1，4-木糖苷鍵，水解產物以木二糖和木三糖為主，以及少量的木糖和阿拉伯糖［2］。木聚糖酶在食品、造紙、飼料等領域都有廣泛的應用。目前，低聚木糖主要通過酶法降解木聚糖制備。篩選和制備高活性和高底物特異性的木聚糖酶組分，以獲得二糖、三糖比例高，單糖比例低的水解產物是生產低聚木糖的技術關鍵。傳統的方法是通過菌種篩選和發酵控制獲得高木聚糖內切酶活性、低木糖苷酶活性的木聚糖酶，但此法酶活性低、發酵工藝不穩定。利用畢赤酵母表達里氏木霉的木聚糖內切酶，發酵生產只有內切酶活性而沒有糖苷酶活性的木聚糖酶，用于生產低聚木糖，能夠達到簡化產酶工藝、提高產物純度和產量的目的。本實驗室前期構建的pPIC9-xyn2表達載體能夠有效地表達xyn2基因，但AOX1啟動子仍不太恰當、方便，使AOX1啟動子應用受限。本研究從啟動子和信號肽的替換入手，構建新型畢赤酵母分泌表達載體，獲得安全高效分泌表達木聚糖酶基因的工程菌。通過添加Triton等非離子表面活性劑增加膜的通透性，提高外源蛋白的分泌能力［3］，以期獲得更高的表達量，進一步對重組木聚糖酶的水解產物進行分析，探討應用其生產低聚木糖的可行性，以期為低聚木糖的生產探索新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

畢赤酵母菌株 GS115、大腸桿菌菌株 E.coli DH5α、質粒pPIC9-xyn2、T-GAP、pT-αM、pGAPHa均由本研究室保存；pMD18-T載體、T4DNA連接酶、Pyrobest Taq酶、限制性內切酶 均購自大連寶（TaKaRa）生物工程公司；DNA膠回收試劑盒 購自北京百泰克生物技術有限公司；其它試劑 均為國產分析純；YPD、MD培養基 見 Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的說明書。

1.2 實驗方法

1.2.1 菊粉酶基因信號肽INU的密碼子優化 參照文獻［4］，根據畢赤酵母密碼子用法表［5］，優化菊粉酶信號肽序列INU并設計合成接頭。經密碼子改造后的接頭序列如下：

1.2.2 畢赤酵母表達載體的構建 質粒DNA提取、電泳、酶切、大腸桿菌感受態制備、轉化等操作參見《分子克隆實驗指南》（第三版）［6］，表達載體轉化子的鑒定通過菌落PCR和酶切的方法進行。

1.2.2.1 畢赤酵母表達載體pGAPHα-xyn2的構建畢赤酵母表達載體pGAPHα-xyn2的構建過程如圖1所示。以 BamHI、EcoT221雙酶切 pPIC9-xyn2和T-GAP載體，分別回收約 8000bp的大片段和約500bp的GAP啟動子片段，連接，轉化，構建成畢赤酵母表達載體pGAPHα-xyn2。

圖1 畢赤酵母表達載體pGAPHα-xyn2的構建

1.2.2.2 畢赤酵母表達載體pGAPHINU-xyn2的構建

畢赤酵母表達載體pGAPHINU-xyn2的構建過程如圖2所示。以BamHI、SnaBI雙酶切 pGAPHαxyn2，回收約8000bp的大片段，與經密碼子優化的菊粉酶基因信號肽INU連接，構建成畢赤酵母表達載體pGAPHINU-xyn2。

圖2 畢赤酵母表達載體pGAPHINU-xyn2的構建

1.2.2.3 畢赤酵母表達載體pGAPHαM-xyn2的構建

畢赤酵母表達載體pGAPHαM-xyn2的構建如圖3所示。BamHI、XolI雙酶切pGAPHα，BglⅡ、XolI雙酶切T-αM，分別回收約8000bp和300bp的片段，連接，轉化大腸桿菌，構建中間表達載體pGAPHaM，然后用EcoRl和Notl分別酶切pGAPHaM和pGAPHaxyn2，回收目的片段，連接，轉化，構建成表達載體pGAPHaM-xyn2。

圖3 畢赤酵母表達載體pGAPHαM-xyn2的構建

1.2.3 畢赤酵母的轉化 參照Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的說明書（P59），采用電擊法轉化畢赤酵母。

1.2.4 木聚糖酶活性的測定 用YPD培養基培養酵母72h后，4000r/min離心5min，取上清DNS法［6］測定木聚糖酶活性。

酶活單位定義：在設定的溫度及pH條件下，1min從底物溶液中分解產生1μmol還原糖（表示為還原糖當量）所需要的酶量為一個酶活單位，簡稱IU。

1.2.5 Triton的添加 挑取單菌落用YPD培養基振蕩培養24h后添加Triton，使其終濃度為0.01%，培養72h后，4000r/min離心5min，取上清DNS法測酶活。

1.2.6 木聚糖酶酶解產物的分析 采用薄層層析法。1.5mL 5%的木聚糖與同體積的木聚糖酶在50℃水浴中反應10min，5000r/min離心4min，上清在50℃烘箱中濃縮至體積約為200μL，用微量進樣器吸取約0.2μL上清液，點樣于0.25mm厚的硅膠板上，上行法展開后，噴顯色劑，將薄層層析板置于105℃的烘箱中烘10min顯色。展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水（體積比為2∶1∶1），顯色劑為苯胺-鄰苯二甲酸（苯胺0.93g、鄰苯二甲酸1.66g，溶于水飽和的正丁醇100mL中）。

2 結果與分析

2.1 畢赤酵母表達載體pGAPHα-xyn2的構建

將pGAPHα-xyn2的質粒用BamHI、EcoT221雙酶切，切出來約8100、500bp的片段，如圖4所示，表明載體構建成功。

2.2 畢赤酵母表達載體pGAPHINU-xyn2的構建

將pGAPHINU-xyn2和pGAPHa-xyn2的質粒分別用BamH1和Notl雙酶切，分別酶切出8000、650bp和8000、950bp的兩對片段，如圖5所示，載體構建成功。

圖4 pGAPHα-xyn2雙酶切鑒定

圖5 pGAPHINU-xyn2雙酶切鑒定

2.3 畢赤酵母表達載體pGAPHαM-xyn2的構建

中間表達載體pGAPHaM的鑒定如圖6所示，因BamHI和BglⅡ屬同尾酶，連接后無酶切位點，采用PCR的方法鑒定，上游引物為GAP啟動子的下游引物，下游引物為木聚糖酶基因的上游引物，可清晰地看見870bp的片段，表明載體構建成功。將pGAPHaxyn2的質粒用BamHI和Notl雙酶切，酶切成8300bp和570bp的兩個片段，如圖7所示，載體構建成功。

圖6 pGAPHaM的PCR鑒定

圖7 pGAPHαM-xyn2雙酶切鑒定

2.4 表達載體的轉化及酶活性鑒定

用BglⅡ酶切不同的表達載體，使質粒線性化，電擊法轉化畢赤酵母GS115，篩選轉化子。將轉化子在YPD培養基中振蕩培養72h，離心取上清液，測定木聚糖酶活性，以畢赤酵母誘導型表達載體pPIC9-xyn2為對照，實驗結果見表1。

表1 不同表達載體表達xyn2的酶活性

2.5 添加Triton的影響

結果見表2。

表2 添加Triton的影響

2.6 酶解產物分析

如圖8所示，木聚糖酶的酶解產物為以木二糖和木三糖為主的低聚木糖，以及少量的木糖。

圖8 酶解產物分析

3 討論

啟動子在基因表達過程中具有很重要的作用，本文用GAP啟動子替換pPIC9-xyn2上的AOX啟動子，構建組成型表達載體pGAPHα-xyn2。在生產和應用過程中無需甲醇誘導，大大增加了安全性。同時，轉化過程中無抗生素基因被引入，也增加了安全性。盡管在本實驗中與AOX啟動子相比，GAP啟動子調控的xyn2基因表達水平稍低，但是在安全性方面的優勢使其有望在食品等領域得到廣泛應用。

重組蛋白的分泌表達對于提高表達量和產品的純化都是有利的，在畢赤酵母中，信號肽對不同的異源蛋白分泌效率有很大的差異［8］。不同的信號肽對木聚糖酶的引導能力有所不同，其中以改造后的α信號肽最強，比原來的信號強增強了約24%，優化的INU信號肽雖然不如α信號肽強，但在畢赤酵母中也能有效引導外源蛋白的分泌。

對于液體搖瓶培養來說，在培養基中添加某些表面活性劑可能會提高酶的產量。表面活性劑所起的作用可能是改變細胞膜的通透性，并提高氧在氣液界面的傳遞速度［9］。實驗表明，添加一定量的Triton，可以有效提高細胞分泌外源蛋白的能力，使酶活顯著提高。

重組木聚糖酶的酶解產物主要為木二糖和木三糖，僅有少量的木糖，可用于低聚木糖的生產。

［1］Techapun C，Poosaran N，Watanabe M，et al.Thermostable and alkaline-tolerant microbial cellulose-free xylanases produced from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching bioprocesses：a review［J］.Process Biochem，2003，38：1327-1340.

［2］Neeta K，Abhay S，Mala R.Molecular and biotechnological aspects of xylanases［J］.FEMS Microbiology Reviews，1999，23：411-456.

［3］Pingzuo Li，Anukanth Anumanthan，Xiu-GongGao. Expression of Recombinant Proteins in Pichia Pastoris［J］.Appl Biochem Biotechnol，2007，142：105-124.

［4］Bong Hyun Chung，Soo Wan Nam.Biotechnol Bioeng［M］. 1996：47-479.

［5］Da Teng，Ying Fan，Ya-lin Yang.Codon optimization of Bacillus licheniformis β-1，3-1，4-glu-canase gene and its expression in Pichia pastoris［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74：1074-1083.

［6］薩姆布魯克，等.分子克隆實驗指南［M］.第三版.北京：科學出版社，2002：14-138.

［7］Ghose TK.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and Appl Chem，1987，59（2）：257-268.

［8］張樹軍，楊磊，黃瑾.信號肽序列在酵母分泌表達系統中的應用［J］.醫學綜述，2007，13（9）：643-645.

［9］蔡敬民，于宙，張潔，等.曲霉木聚糖酶發酵條件與性質［J］.生物學雜志，1996（2）：14-16.

Study on high efficient and safe expression of recombinant xylanse and its application

BAO Li-juan，SONG Qing-feng，LI Jie*
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Xylanase gene xyn2 from Trichoderma reesei can be expressed efficiently in Pichia pastoris by pPlC9 vector，but it is limited to applicate in food processing for inducing expressing by methanol.Xylanase was expressesed under the controled of GAP promoter instead of AOX promoter of pPlC9 vector.The optimized lNU signal peptide and modified α-Factor signal peptide according to the optimal condon of Pichia pastoris were used to replace the α-Factor signal peptide of pPlC9 vector.The result indicated that the two signal peptides can lead the secrete of xylanase.The secrete ability of foreign protein raised by the addition of 0.01%Triton which could strengthen the permeability of cellular membrance.Result of TLC showed that the enzymolysis product of xylan by the recombinant xylanase were xylobiose，xylotriose and little xylose.

xylanse；GAP promotor；lNU signal peptide；α signal peptide；xylan

Q784

A

1002-0306（2011）01-0156-04

2009-10-16 *通訊聯系人

暴立娟（1980-），女，碩士，研究方向：分子遺傳學與基因工程。