紅毛七乙醇提取物和不同極性部位抗氧化活性的研究

但飛君，鄢文芳，褚立軍，魯文艷，蔡正軍

（三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北宜昌443002）

紅毛七乙醇提取物和不同極性部位抗氧化活性的研究

但飛君，鄢文芳，褚立軍，魯文艷，蔡正軍

（三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北宜昌443002）

主要從清除DPPH自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（）、羥基自由基（·OH）和亞硝酸鹽（）四個方面，研究紅毛七乙醇提取物和不同極性萃取部位的體外抗氧化活性。結果表明，紅毛七乙醇提取物和不同極性部位對DPPH··、·OH、均具有清除能力，其中乙醇提取物、正丁醇與乙酸乙酯中等極性部位抗氧化活性較強，而極性較小的石油醚部位和極性較大的水部位抗氧化作用較弱。

紅毛七，乙醇提取物，極性部位，抗氧化活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅毛七 采自湖北省宜昌市長陽土家族自治縣，經三峽大學生物技術研究中心王玉兵老師鑒定為小檗科紅毛七屬植物紅毛七（Caulophyllum robustum Maxim.）的根；DPPH Sigma公司；鹽酸萘乙二胺 日本東京化工業株式會；其余試劑 均為國產分析純。

AL204電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；N-1001旋轉蒸發儀 愛朗儀器（上海）有限公司；S-3100紫外可見分光光度計 SCINCO公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精密實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 干燥紅毛七粉碎過60目篩，得原藥材粉末。以95%乙醇為溶劑，加熱回流反復提取，減壓濃縮得乙醇總提物（CR）3.6kg?？偺嵛镆?∶1懸浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液經減壓濃縮，即得石油醚部位浸膏（CRP）50.3g、乙酸乙酯部位浸膏（CRE）33.2g、正丁醇部位浸膏（CRB）489.4g、水溶液部位浸膏（CRW）350.2g。

1.2.2 DPPH·清除能力的測定［7-8］精確稱取15.8mg DPPH，溶于100mL無水乙醇，配制成0.4mmol·L-1的DPPH母液。依次精確量取0.05、0.25、0.50、0.75、1.00mL的DPPH母液，稀釋至2.00mL，在517nm下測其吸光度，得標準曲線：Y=1.233X-0.05228，R= 0.99918。

將1.0mL紅毛七乙醇提取物、萃取部位不同濃度的樣品溶液與1.0mL 0.15mmol·L-1的DPPH溶液加入同一試管中，搖勻，放置30min后用溶劑作參比，測定其吸光度Ai，同時測定1.0mL 0.15mmol·L-1的DPPH溶液與1.0mL溶劑混合后的吸光度A0，以及1.0mL紅毛七乙醇提取物、萃取部位不同濃度的樣品溶液與1.0mL溶劑混合后的吸光度Aj。按照下式計算清除率，清除率越大，抗氧化能力越強。

式中：A0：未加抗氧劑時溶液的吸光度；Ai：加抗氧劑后溶液的吸光度；Aj：樣品在測定波長的吸光度。

1.2.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定［9-10］取4.5mL Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH為8.2），于20℃水浴中保溫20min，分別加入1.0mL不同濃度的乙醇提取物和不同極性萃取部位溶液以及0.4mL的鄰苯三酚溶液（25mmol·L-1），混勻后，于25℃水浴中反應5min，加入1.0mL HCl溶液（8mol·L-1）終止反應，在420nm處測定吸光度Ai；空白以蒸餾水代替樣品液，測定吸光度A0；以蒸餾水代替顯色劑測定樣品本身吸光度Aj。按下式計算清除率：

式中：A0：空白對照液的吸光度；Ai：樣品組的吸光度；Aj：樣品溶液吸光度。

1.2.4 羥基自由基清除能力的測定［11］在試管中加入2.0mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖液和1.0mL 1.5mmol·L-1的鄰二氮菲溶液，混勻，加入1.0mL 1.5mmol·L-1FeSO4溶液，立即混勻。加入1.0mL一定濃度的樣品溶液，混勻，加入0.02%的H2O21.0mL，補充體積至8.0mL，37℃保溫1h。在510nm處測定吸光度（此為損傷管吸光度）。同時做樣品空白實驗，另做損傷管和未損傷管，其中損傷管中加入0.02%H2O21.0mL，未損傷管不加H2O2，最后補充各管體積至8.0mL。于37℃下保溫1h，測在510nm下的吸光度，重復兩次，計算其平均值。按下式計算清除率：

式中：A0：未損傷管的吸光度；A1：損傷管的吸光度；A2：加樣品液并扣除樣品空白后的吸光度。

1.2.5 亞硝酸鹽清除能力的測定［12-13］精確量取亞硝酸鈉標準液（5μg·mL-1）0.00、0.20、0.40、0.60、 0.80、1.00mL，分別置于10mL具塞刻度試管中。各加入1.0mL 0.4%的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5min，加入0.5mL 0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，在538nm下測定吸光值，得標準曲線：Y=0.72478X+0.01348，R=0.99986。

準確稱取5μg·mL-1的NaNO2標準溶液兩份各1.0mL，分別置于25mL比色管中，其中一份加入一定量的待測樣品溶液，在37℃恒溫水浴中反應30min，另一份作空白。取出后兩份均立即加入1.0mL 0.4%的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5min后加入0.5mL 0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液，加水至10mL，混勻，靜置15min，以不加NaNO2的樣品溶液的試劑為空白，于538nm處測定吸光值，分別為A1、A2。亞硝酸鹽的清除率按下式計算：

式中：A1：加待測樣品測定的吸光度；A2：未加待測樣品測定的吸光度。

2 結果與討論

2.1 紅毛七乙醇提取物和不同極性部位對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種穩定的自由基，其在可見光區有特征吸收，比色測定簡便、快捷。自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，且顏色變淺的程度與配對電子數是成劑量關系的，因此可用于天然抗氧化劑的篩選。本實驗通過檢測自由基DPPH·的清除率，觀察紅毛七乙醇提取物和不同極性萃取部位在體外對DPPH·有無清除作用，結果如圖1所示。

圖1 紅毛七乙醇提取物及不同極性部位對DPPH·的清除作用

由圖1可知，在測定濃度范圍內，樣品對DPPH自由基都具有一定的清除能力，對DPPH自由基的清除率總體趨勢是隨著濃度的增加而提高，但當濃度增加到一定值后，DPPH·清除率隨濃度增大不再明顯提高，甚至有所下降。其中石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位對 DPPH·的最大清除率分別為52.3%、72.4%、79.0%。乙醇提取物5.0mg·mL-1對DPPH·的清除率達91.4%，正丁醇部位20.0mg·mL-1對DPPH·的清除率達93.4%。正丁醇部位的清除DPPH自由基的作用最強，說明在正丁醇部位中清除DPPH自由基的物質的活性可能最高或含量最高。從實驗過程和實驗結果分析，當樣品濃度增加到一定值時清除率反而有所下降，主要是樣品顏色加深和溶解性問題，使得空白吸光度值較大，導致所得結果的偏差。

2.2 紅毛七乙醇提取物和不同極性部位對超氧陰離子自由基的清除作用

圖2 紅毛七乙醇提取物及不同極性部位對·的清除作用

2.3 紅毛七乙醇提取物和不同極性部位對羥基自由基的清除作用

羥基自由基（·OH）是化學性質活潑的一種活性氧，也是目前已知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，幾乎能與所有的生物大分子發生反應。本實驗以鄰二氮菲-Fe2+為指示劑，采用比色法測定Fenton反應體系產生的·OH，評價樣品對·OH的清除作用，結果如圖3所示。

圖3 紅毛七乙醇提取物及不同極性部位對·OH的清除作用

由圖3可知，在測定濃度范圍內，樣品對·OH都具有一定的清除能力。乙醇提取物、石油醚部位、正丁醇部位對·OH的清除率總體趨勢是隨著濃度的增加而提高，并呈一定的劑量依賴關系，而乙酸乙酯部位濃度增加到一定值后，·OH清除率隨濃度增大不再明顯提高甚至有所下降。石油醚部位對·OH具有一定清除能力，最大清除率達52.4%，而水部位對·OH的清除能力較弱。乙醇提取物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位作用最明顯。乙醇提取物、正丁醇部位40.0mg·mL-1對·OH的清除率分別達85.5%和79.3%，乙酸乙酯部位10.0mg·mL-1對·OH的清除率達78.2%。乙酸乙酯、正丁醇部位的清除·OH的作用強，說明在乙酸乙酯部位、正丁醇部位中清除·OH的物質的活性可能較高或含量高。實驗過程中當樣品因濃度較高或極性較小出現溶解性問題時，雖然顏色變化明顯但通過吸光度測定后計算結果卻顯示活性不好。

亞硝酸鹽與仲胺在人體中易合成強致癌物質亞硝胺，亞硝胺能引起人體和動物的肝臟等多種器官的惡性腫瘤，因此在體內外清除亞硝酸鹽以阻斷亞硝胺的合成是防治癌癥的有效途徑之一。本實驗通過檢測對的清除率，觀察紅毛七乙醇提取物的不同極性部位在體外對有無清除作用，結果如圖4所示。

圖4 紅毛七乙醇提取物及不同極性部位對的清除作用

3 結論

實驗對紅毛七95%乙醇提取物和不同極性萃取部位的體外抗氧化研究結果表明：乙醇提取物和不同極性部位均具有抗氧化作用，其中以正丁醇與乙酸乙酯中等極性部位活性較強，而極性較小的石油醚部位和極性較大的水部位抗氧化作用較弱，這提示乙酸乙酯相和正丁醇相是其主要活性部位。另外在不同的自由基產生體系中，提取物和不同極性部位抗氧化活性強弱不盡相同。從DPPH·清除能力的測定中可知，最大清除率的順序為：正丁醇部位＞乙醇提取物＞水部位＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位；對·的最大清除率的順序為：乙酸乙酯部位＞乙醇提取物＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位；對·OH的最大清除率的順序為：乙醇提取物＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞水部位；對的最大清除率的順序為：正丁醇部位＞乙酸乙酯部位＞水部位＞乙醇提取物。相同極性部位的提取物在不同的自由基體系中，其清除能力也不同。就正丁醇部位而言，對DPPH·的最大清除率為93.4%，對·的最大清除率達64.7%，對·OH的清除率達79.3%，對的最大清除率為80.6%。這可能與紅毛七提取物的不同極性部位中所含抗氧化成分的種類和結構有關，故在不同的抗氧化體系中，不同極性部位的抗氧化作用不同。

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Study on antioxidant activities of ethanol extract and different polar fractions of Caulophyllum robustum Maxmi.

DAN Fei-jun，YAN Wen-fang，CHU Li-jun，LU Wen-yan，CAI Zheng-jun

（Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development，China Three Gorges University，Yichang 443002，China）

The antioxidant activities of ethanol extract and different polar fractions of Caulophyllum robustum Maxmi. were evaluated by DPPH radical scavenging activity（DPPH·），superoxide radical scavenging activity（O2-·），hydroxyl radical scavenging activity（·OH）and NO2-scavenging assays.The results showed that ethanol extract and different polar fractions displayed high antioxidant activities.ln totally，the antioxidant activities of middle polar fractions were stronger than those of lower and higher polar fractions.

Caulophyllum robustum Maxmi.；ethanol extract；polar fraction；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0068-04

2009-12-18

但飛君（1972-），女，博士，副教授，主要從事天然產物的活性成分研究。

生物資源保護與利用湖北省重點實驗室開放基金項目（2007005）。