噴霧干燥對發酵乳桿菌KLDS1.0709存活影響的研究

郭 云，孟祥晨

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室/食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

噴霧干燥對發酵乳桿菌KLDS1.0709存活影響的研究

郭 云，孟祥晨*

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室/食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

研究噴霧干燥對高抗氧化活性發酵乳桿菌KLDS1.0709存活的影響。以脫脂乳為菌體懸浮基質，研究不同出風溫度對該菌噴霧干燥后菌體存活率的影響，然后在脫脂乳中添加不同比例的海藻糖和蔗糖，比較不同基質對菌體存活率的影響。結果表明，隨出風溫度的升高，菌體存活率和水分含量均降低；當出風溫度為75℃時，菌體存活率為62.98%，殘留水分含量為5.80%。以10%脫脂乳+5%海藻糖+5%蔗糖為基質進行噴霧干燥，菌體存活率最高達73.90%，表明海藻糖和蔗糖與脫脂乳混合作為基質時可提高該菌噴霧干燥后的存活率。

噴霧干燥，脫脂乳，發酵乳桿菌，海藻糖，蔗糖

乳酸桿菌是人類有益腸道菌群的重要組成菌種之一，具有許多重要的生理功能［1］，抗氧化活性是其重要的生理功能之一，具有抗氧化活性的乳桿菌能夠在攝取食物的過程中降低活性氧聚積，減少超氧負離子和過氧化氫的含量［2］。Kullisaar等人報道了從健康的嬰兒腸道中分離出兩株具有抗氧化活性的發酵乳桿菌E-3和E-18，它們含有大量的谷胱甘肽和過氧化物歧化酶（SOD），能夠抑制脂質過氧化物反應，減少過氧化氫含量，維護腸道生態系統并抑制內源性和外源性的氧化應激反應［3］。本研究前期從50株益生菌中已篩選出一株具有抗氧化活性的發酵乳桿菌KLDS1.0709，將這株具有抗氧化活性的益生菌制備成菌粉，目前常用的兩種方法是冷凍干燥和噴霧干燥［4］。在食品工業中，與冷凍干燥相比，噴霧干燥具有設備簡單、成本低等優點，適合益生菌大規模生產、運輸和儲存，是商業化制備益生菌產品普遍采用的方法。許多研究報道了噴霧干燥技術在制備益生菌產品中的應用［5］。然而在噴霧干燥過程中，益生菌與高溫空氣充分接觸，盡管時間短，但熱力作用還是會導致菌體死亡，制備的干燥菌粉活菌數較低。因此，采用噴霧干燥制備益生菌粉時需考慮菌體的存活率問題。本研究的主要目的是通過優化噴霧干燥參數和使用不同菌體懸浮基質來減少噴霧干燥對發酵乳桿菌存活率的影響，為該菌的商業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）KLDS1.0709乳品科學教育部重點實驗室保藏；優化后的玉米漿液體培養基 玉米漿粉100g，葡萄糖40g，吐溫-80 2g，K2HPO46g，檸檬酸鈉6g，MgSO40.6g，MnSO40.6g，蒸餾水2L，調pH到6.0，121℃滅菌15min；MRS培養基；脫脂乳 蛋白質含量為35%，新西蘭；海藻糖純度≥99%，上海倍翔；蔗糖 食品級，天津光復科技；其它試劑 均為分析純。

Delta320 pH計 瑞士梅特勒-托利多集團；HVE-50高溫高壓滅菌鍋 日本平山公司；DHP-9272電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；VD-1320潔凈工作臺 北京東聯哈爾濱儀器制造有限公司；GL-21高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；瑞士比歐KLF2000型發酵罐 瑞士比歐生物工程公司；XK96-A快速混勻振蕩器 姜堰市新康醫療器械有限公司；B-290噴霧干燥儀 瑞士Buchi（布奇）公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化及發酵培養 將發酵乳桿菌KLDS1.0709接種于MRS液體培養基中，于恒溫箱中35℃培養12h，連續活化三代，以提高菌株活力。

配制玉米漿液體培養基，然后將其倒入3.7L發酵罐，121℃滅菌15min，當溫度降至30℃時，以1%接種量接種發酵乳桿菌KLDS1.0709培養液，在35℃恒 pH6.0條件下發酵培養 12h，攪拌速度為100r/min。

1.2.2 菌懸液的制備 發酵結束放罐后，將發酵液在4℃、6000×g離心10min后，傾倒上清液，獲得的菌體細胞再用PBS緩沖溶液清洗兩次，將最后獲得的菌體細胞通過混勻振蕩器懸浮在相應的基質中。

1.2.3 基質的制備 按照表1制備相應的菌體懸浮基質。

表1 噴霧干燥基質的配比

1.2.4 噴霧干燥 參考Ananta E（2005）的方法進行噴霧干燥，進料速度恒定為5mL/min，通過調節進風溫度使出風溫度在70～90℃之間［6］，干粉樣品從旋風分離器下收集。

1.2.5 活菌計數 采用平板菌落計數法［7］。

1.2.6 存活率測定 發酵乳桿菌存活率（%）=（噴霧干燥后發酵乳桿菌的活菌數/噴霧干燥前發酵乳桿菌的活菌數）×100%

1.2.7 水分含量測定 采用烘干方法測定產品的水分含量，將裝有3g樣品的鋁盒放入（102±2℃）的烘箱中加熱，直至恒量，重復上述操作，直到兩次連續稱量質量之差不超過0.0005g（GB/T 5413.8-1997）。

式中，m1：加入樣品后鋁盒和蓋的最初質量，g；m2：樣品烘干后兩次稱量獲得的最小質量，g；m3：樣品的質量，g。

1.2.8 產品微觀結構的觀測 制備后的菌粉樣品采用掃描電子顯微鏡的方法觀察其微觀結構特征。具體操作步驟如下：a.粘樣：將少許樣品均勻地粘貼在掃描電鏡樣品臺上；b.鍍膜：用W-1010（Giko）型離子濺射鍍膜儀在樣品表面上鍍上一層1500nm厚的金屬膜（金或鉑膜）；c.將處理好的樣品放入樣品盒中待檢；d.開機，采用加速電壓20kV測量樣品。

2 結果與討論

2.1 不同出風溫度對噴霧干燥后菌體存活的影響

以20%脫脂乳為基質進行噴霧干燥，不同的出風溫度對噴霧干燥后發酵乳桿菌KLDS 1.0709存活率的影響見圖1。

圖1 不同出風溫度對發酵乳桿菌KLDS1.0709噴霧干燥后存活率及殘留水分含量的影響

從圖1中可以看出：隨出風溫度的升高，菌體的存活率呈線性下降，當出風溫度從70℃升高到85℃時，菌體存活率從74.37%急劇降低到33.18%。菌粉的水分含量也隨出風溫度的升高而從7.63%降至2.94%。從食品儲藏玻璃化溫度的角度考慮，25℃適宜乳粉儲藏的殘留水分含量的臨界值為7%［8］。產品干燥后殘留水分含量低于7%能減少儲藏過程中產生的不良影響，例如乳糖結晶等。而且根據實際情況，應該選擇高存活率和低水分含量的參數，因此綜合考慮上述因素，確定適合發酵乳桿菌KLDS1.0709噴霧干燥的出風溫度為75℃，此時的菌體存活率為62.98%，殘留水分含量為5.80%。

Gardiner G E等研究了噴霧干燥對副干酪乳桿菌NFBC338和唾液乳桿菌UCC118的存活率的影響［9］，同樣以脫脂乳為基質，不同出風溫度的實驗顯示，出風溫度在75℃最佳，該溫度下獲得菌粉的殘留水分含量為5%左右，NFBC338和UCC118的存活率分別為66%和1%。本研究采用的發酵乳桿菌KLDS1.0709在最適出風溫度75℃時菌體存活率為60%左右，與副干酪乳桿菌接近。

2.2 不同基質對噴霧干燥后菌體存活的影響

將蔗糖和/或海藻糖添加至脫脂乳中，作為菌體懸浮基質在出風溫度為75℃的條件下進行噴霧干燥，結果如圖2所示。

從圖中可以看出，以20%脫脂乳為基質時菌體的存活率可達60.22%，當以10%脫脂乳與10%蔗糖混合為基質時，菌體存活率提高5.68%，當以10%脫脂乳與10%海藻糖混合為基質時，菌體存活率提高8.52%，當海藻糖和蔗糖分別以5%混合添加至10%脫脂乳中時，菌體的存活率達最高，為73.90%，比20%脫脂乳為基質時的存活率提高13.68%。

從上述結果可以看出，海藻糖和蔗糖在噴霧干燥脫水的過程中對菌體具有一定的保護作用，與Zaye等人研究利用海藻糖和蔗糖作為唾液乳桿菌唾液亞種（UCC500）凍干保護基質的結果相似，在脫脂1-20%脫脂乳；2-10%脫脂乳+10%海藻糖；3-10%脫脂乳+10%蔗糖；4-10%脫脂乳+5%海藻糖+5%蔗糖乳中添加海藻糖或蔗糖比不添加的菌體凍干存活率要高，而且當海藻糖和蔗糖兩者混合添加到脫脂乳中比兩者單獨分別添加到脫脂乳中保護效果要好［10］。

圖2 不同噴霧干燥基質對發酵乳桿菌KLDS1.0709存活率及水分含量的影響

研究表明，糖類物質由于具有替代水分子以及形成玻璃態的能力，在凍結和干燥過程中對細胞膜有很好的保護作用，同時對蛋白質、脂質體、原核細胞等生物系統的冷凍干燥和噴霧干燥有抑制損傷的作用，Leslie SB等人發現，海藻糖和蔗糖在冷凍干燥過程中對大腸桿菌和蘇云芽孢桿菌起到了很好的保護作用，主要是由于海藻糖和蔗糖在干燥階段能夠保護細胞膜維持蛋白質結構的穩定［11］。

2.3 噴霧干燥菌粉的表征

不同懸浮基質噴霧干燥后形成菌粉的掃描電鏡觀察如圖3所示，干燥后的微粒都大體呈球形，與Charpenntier［12］的觀察相似，以脫脂乳為主要基質的微球表面有裂縫出現，這些裂縫有利于干燥后顆粒內部熱量的排出，減少熱對內部菌體的傷害。

圖3 四種基質噴霧干燥菌粉的微觀結構（放大3000倍）

從圖中可以看出，5%海藻糖+5%蔗糖+10%脫脂乳懸浮基質噴霧干燥后形成的微粒比其他三種基質的微粒形態更圓潤，而10%蔗糖+10%脫脂乳為基質的微粒和20%脫脂乳為基質的微粒表面有明顯干燥脫水后行成的凹坑。

3 結論

綜合考慮噴霧干燥菌體存活率和殘留水分含量，選擇最佳的噴霧干燥出風溫度為75℃，此時的菌體存活率為62.98%，殘留水分含量為5.80%。

當海藻糖和蔗糖與脫脂乳混合為噴霧干燥基質時可提高菌體的存活率，其中10%脫脂乳+5%海藻糖+5%蔗糖為噴霧干燥基質時，菌體的存活率最高，達73.90%。

由掃描電鏡可知菌粉微粒大體呈球型，微球表面有裂縫并且凸凹不平，粒徑分布不均勻，大體在30～500μm之間。

［1］Fuller R.Probiotics in human medicine［J］.Gut，1991（32）：439-451.

［2］Kaizu M M，Sasaki M，Nakajima H，et al.Effect of antioxidative lactic acid bacteria on rats fed a diet deficient in vitamin E［J］.Journal of Dairy Science，1993（76）：2493-2499.

［3］Kullisaar T，Zilmer M，Mikelsaar M，et al.Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics［J］.International Journal of Food Microbiology，2002（72）：215-224.

［4］Meng X C，Stanton C，Fitzgerald G F，et al.Anhydrobiotics：The challenges of drying probiotic cultures［J］.Food Chemistry，2008，106：1406-1416.

［5］曲微，范俊華，霍貴成.益生菌噴霧干燥技術的研究進展［J］.中國乳業，2008（4）：36-38.

［6］Ananta E，Volkert M，Knorr D.Cellular injuries and storage stability of spray-dried Lactobacillusrhamnosus GG［J］. International Dairy Journal，2005（15）：399-409.

［7］沈萍，范秀容，李廣武，等.微生物學實驗［M］.第三版.北京：高等教育出版社，2005：92-95.

［8］Collins G F，Ross J K，R P，et al.Comparative survival rates of human-derived probiotic Lactoba-cillus paracasei and L. salivarius strains during heat treatment and spray drying［J］. Applied Environmental and Microbiology，2000（66）：2605-2612.

［9］Gardiner G E，O′Sullivan E，Kelly J，et al.Comparative survival rates of human derived probiotic Lactobacillus paracasei and L.salivarius strains during heat treatment and spray drying［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000（6）：2605 -2612.

［10］Zayed G，Roos Y H.Influence of trehalose and moisture content on survival of Lactobacillus salivarius subjected to freezedrying and storage［J］.Process Biochemistry，2004（39）：1081 -1088.

［11］Leslie SB，Israeli E，Lighthart B，et al.Trehalose and sucrose protect both membrane and proteins in intact bacteria during drying［J］.Applied Environmental and Microbiology，1995，61：3592-3597.

［12］ Charpentier C A，Gadille P，Digat B，et al. Microencapsulation of rhizobacteria by spray drying：formulation and survival studies［J］.Journal of Microencapsulation，1998，15：639-659.

Survival of Lactobacillus fermentum KLDS1.0709 after spray-drying

GUO Yun，MENG Xiang-chen*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Food Scienceamp;Technology College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Lactobacillus fermentum KLDS1.0709 was first spray-dried with skim milk at different outlet temperatrure to investigate the microbial survival rate.Furthermore，trehalose or/and sucrose was/were included in the skim milk to assess their protection capacity.The results indicated that the survival rate and the residual moisture content decreased with increasing outlet temperatures.A microbial survival rate of 62.98%and a residual moisture content of 5.80%were achieved at an outlet temperature of 75℃.5%trehalose+5%sucrose in addition to skim milk were the most efficient materials giving a survival rate of 73.90%after spray-dring.Trehalose and sucrose greatly enhanced survival rate when they were used together with skim milk.

spray-drying；skim milk；Lactobacillus fermentum；trehalose；sucrose

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0109-03

2010-01-20 *通訊聯系人

郭云（1983-），女，碩士，研究方向：食品微生物。

國家863項目（2008AA10Z335）資助。