單級連續發酵生產D－核糖*

張生克，閆世梁，黃惠英，史小利，李林，朱騰躍，崔鳳霞

(鄭州拓洋實業有限公司技術中心，河南 鄭州，450001)

D-核糖是五碳糖，生物體內核糖核酸、核苷酸輔酶類的構成成分，又是一種還原型誘導物，承擔生物體內重要活性功能?？蓮V泛應用于食品及醫藥工業，是合成VB2的重要原料，也是合成抗病毒、抗腫瘤藥物的中間體［1］。分批發酵法是目前工業生產D-核糖最普遍的方法，但生產效率低、投資大，且勞動強度大，連續發酵是新興的發酵工藝［2－4］，具有簡單、高效、穩定、連續的優點。因此，我們進行了D-核糖連續發酵過程的研究，探求工業生產上采用連續發酵的可能性，為提高D-核糖的發酵生產水平提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)轉酮醇酶(Transketolase)變異株XB02，由鄭州拓洋實業有限公司技術中心保藏。

1.2 實驗裝置

采用GRJD型自控式發酵罐，由5L種子罐和30L發酵罐組成，鎮江格瑞生物工程有限公司制造。

1.3 培養基

1.3.1 肉湯培養基

牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、可溶性淀粉2.0%、NaC1 0.5%、酵母膏0.1%，pH 7.0，加入瓊脂2.0%則為固體培養基。該培養基用于菌種的保藏、擴增及活化等。

1.3.2 種子培養基

葡萄糖2.0%、酵母膏 0.35%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%，pH 7.0。

1.3.3 發酵培養基

葡萄糖20%、玉米漿3%、(NH4)2SO40.6%、CaCO33.6%、MnSO4·4H2O 0.005%，pH 7.0。

1.4 實驗方法

1.4.1 種子制備

將保藏菌種接入搖瓶培養基中36℃，200 r/min，培養12～20 h，然后轉接至5 L種子罐中，設定攪拌轉速400 r/min，溫度 36℃，壓力 0.06 MPa，通氣量0.5(vvm)，培養16～24 h。

1.4.2 連續發酵流程

單級連續發酵在30 L自控發酵罐中進行。在一定底物濃度下，先進行分批發酵，待菌體生長到達對數生長期末時轉入連續發酵，控制稀釋率，即將儲罐中滅過菌的發酵培養基通過蠕動泵連續流加入發酵罐，同時溢流口連續溢出發酵液以保持發酵體積不變。發酵溫度控制在(35±0.5)℃，罐壓為0.08 MPa，攪拌轉速 360 r/min，通氣量為 1∶0.5(v/v/m)。

1.5 測定方法

D-核糖含量的檢測:采用苔黑酚法［5］。

菌體生長量(OD值)的測定:用蒸餾水稀釋發酵液40倍，以蒸餾水作空白，用721分光光度計測定發酵液在590 nm處的光密度。

殘糖含量:采用SBA-40C型生物傳感分析儀進行測定。

1.6 計算方法［6］

2 結果與分析

2.1 連續發酵起點的確定

研究表明，可以通過分批發酵的生長曲線和糖利用曲線等來判斷連續發酵起點。Daniel［7］等判斷連續發酵起點的標準是:正常分批發酵的條件下，當O2的吸收率快速上升、光密度達到分批發酵條件下可能達到的最大光密度的40% ～80%時，開始以一定的稀釋率放料，隨之轉為連續發酵的操作方式。圖1為分批發酵過程中OD590nm、溶氧、殘糖和D-核糖產量隨培養時間變化曲線，可以看到，發酵24 h時，O2吸收率最大，溶氧達到最低。且此時OD590nm達到最大值的約67%。按照上述標準，選擇24 h作為連續發酵的起點，此時將儲罐中滅過菌的發酵培養基通過蠕動泵以一定流速連續流加入發酵罐，同時從溢流口以相同的流速連續溢出發酵液，轉為連續發酵。

圖1 分批發酵生產D-核糖的一般規律

2.2 稀釋率對D-核糖單級連續發酵的影響

單級連續發酵流加底物糖濃度為200 g/L，通過改變不同稀釋率研究其對D-核糖單級連續發酵影響，測定殘糖濃度、菌體生長量(OD)、D-核糖濃度，并計算出D-核糖收率，結果如表l所示?？梢钥闯?，隨著稀釋率增加，發酵罐中的菌體生長量(OD)和D-核糖濃度不斷下降，而殘糖濃度逐漸升高。此外，隨著底物流加速率提高，D-核糖收率也在不斷下降。

表1 不同稀釋率對D-核糖單級連續發酵的影響

根據表1數據計算出不同稀釋率下的糖消耗速率和D-核糖產率，結果如圖2所示?？梢钥吹?，糖消耗速率隨稀釋率加大而提高。這主要是因為稀釋率較低時，流加的還原糖在發酵罐中停留時間較長，被菌體利用得較為充分，糖消耗速率較低;在稀釋率較高時，還原糖在發酵罐中停留時間較短，來不及被利用就流出罐外，因此糖消耗速率呈明顯的增加趨勢。而隨著稀釋率提高，D-核糖產率呈現先增加而后下降的過程，當稀釋率為0.06 h－1時，D-核糖產率達到最大的4.07 g/(L·h)。

圖2 稀釋率對單級連續發酵糖消耗速率和D-核糖產率的影響

綜上，稀釋率對D-核糖單級連續發酵的影響較大，當稀釋率為 0.06 h－1時，D-核糖產率最大，可達4.07 g/(L·h)，為最佳稀釋率。此時，發酵罐殘糖濃度為1.47%，OD590nm為0.633，D-核糖濃度為67.9 g/L，D-核糖收率 41.0% 。

2.3 流加糖濃度對D-核糖單級連續發酵的影響

固定稀釋率為0.06 h－1，改變流加糖初始濃度研究其對D-核糖單級連續發酵的影響。測定殘糖濃度、糖利用率、菌體生長量(OD)和D-核糖濃度，結果見表2。由表2可見，連續發酵過程中，在底物糖流加速度一定的情況下，隨著流加糖濃度提高，發酵醪液的殘糖濃度不斷增加，糖利用率卻不斷下降，菌體生長量(OD)從0.414增大到0.647，其后變化不大。D-核糖濃度則從最初的40.1 g/L增加到流加糖濃度為200 g/L時的68.7 g/L，糖濃度繼續增加，D-核糖濃度始終保持在67 g/L左右。

表2 不同流加糖濃度對對D-核糖單級連續發酵的影響

流加糖濃度對糖消耗速率、D-核糖產率的影響見圖3。隨著流加糖濃度由50 g/L增加到200 g/L，糖消耗速率由2.99 g/(L·h)快速增至11.90 g/(L·h)，此后增加緩慢。D-核糖產率在流加糖濃度為50 g/L時為2.1 g/(L·h)，200 g/L時達到最大的4.12 g/(L·h)，此后略有下降。

圖3 流加糖濃度對單級連續發酵消耗速率和D-核糖產率的影響

因此，在一定的稀釋率條件下，流加糖濃度對D-核糖單級連續發酵影響較大，并且流加糖濃度維持在一定范圍內效果較好，繼續提高流加糖濃度并不會使D-核糖產率加，反而導致糖利用率降低，造成浪費。稀釋率為0.06 h－1時，最佳的流加糖濃度為200 g/L。

2.4 D-核糖單級連續發酵穩定性研究

單級連續發酵在30L自控發酵罐中進行，發酵溫度控制在 (35±0.5)℃，罐壓為0.08 MPa，攪拌轉速360 r/min，通氣量為1∶0.5。發酵罐中初始還原糖濃度為200 g/L，發酵24 h后開始以0.06 h－1的稀釋率，將儲罐中滅過菌的糖濃度為200 g/L的發酵培養基通過蠕動泵連續流加入發酵罐，同時溢流口以相同的速率連續溢出發酵液，連續發酵160 h，結果如圖4所示。

圖4 連續發酵160 h各參數變化曲線

可以看到，D-核糖單級連續連續發酵約48 h后基本達到穩態，此后發酵醪液中的殘糖濃度、溶氧、菌體生長量(OD)和D-核糖濃度均在一定的范圍內波動，連續穩定發酵160 h，效果良好。

3 結論

(1)發酵24 h時，O2吸收率最大，溶氧達到最低，且此時菌體達到對數生長中期，因此選擇24 h流加培養基，開始連續發酵。

(2)研究了稀釋率、流加糖濃度對D-核糖單級連續發酵的影響，結果表明:稀釋率為0.06 h－1，流加糖濃度為200 g/L時，D-核糖產率達到最大，可達4.0 g/(L·h)以上。

(3)以上述條件進行D-核糖單級連續連續發酵，約48 h后基本達到穩態，連續穩定發酵160 h，效果良好。

［1］ 邱蔚然，高淑紅．發酵法生產D-核糖［J］．工業微生物，2003，30(1):58 －64．

［2］ Lee W G，Park B G，Chang Y K，et al.Continuous ethanol production from concentrated wood hydrolusates in an internal membrane-filtration bioreactor［J］．Biotechnol Prog，2000，16(2):302－304

［3］ 李中兵，魏 轉，楊曉軍，等．連續發酵研究及其應用進展［J］．食品科學，2007，28(11):624 －627

［4］ Grootjen D R ，Jansen M L，Luyben K Ch A m，et al.Reaactors in series for the complete conbversion of glucose/xylose mixtures by Pichia stipitis and Saccharomyces cerevisiae［J］．Enzyme Microb Technol，1991，13(10):829 －833.

［5］ 彭其安，張西峰，吳思方，等．同源重組法構建枯草芽孢桿菌轉酮酶缺失突變菌株［J］．生物技術，2006，16(6):23－16．

［6］ 王杏文，季更生，勇強，等．樹干畢赤酵母單級連續發酵制取乙醇的研究［J］．南京林業大學學報:自然科學版，2007，31(5):6 －10．

［7］ Daniel N B．Enhanced product formation in continuous fermentations with microbial cell recycle［J］．Biotechnol Bioeng，1981，23(2):373 －389．