海南蒲桃果實原花青素的提取*

張鏡，刁樹平

(嘉應學院生命科學學院，廣東梅州，514015)

原花青素是一類天然自由基清除劑與抗氧化劑，具有抗輻射、抗突變，防癌、增強免疫、延緩衰老、改善腸道菌群等多種生物活性，廣泛應用于醫藥保健、功能性食品及化妝品等［1－6］。但生產原花青素的原料來源受季節與區域等的限制，產品供不應求，價格昂貴。原花青素的研發雖逾半個世紀，而尋求原花青素含量高、原料成本低廉的植物資源，仍是天然活性產物研發的重要課題［7－9］。

海南蒲桃［S.cumini］，別名烏墨、楠木，是我國熱帶、南亞熱帶地區野生常綠喬木，喜溫暖濕潤氣候，對土壤要求不高，適宜在5～10 cm以上的沙壤土及表層為紅壤或黃壤土中生長，并有火燒不死之稱［10］。海南蒲桃花多實豐，果實內含多種成分，具有治療糖尿病、痢疾等疾病的藥用價值，鮮果生食對慢性咳嗽和哮喘有治療效果，是一種藥效很好的野生水果。我國華南地區海南蒲桃大量用于行道及水源涵養林種植。但海南蒲桃果實一直沒開發利用，大量海南蒲桃原花青素資源長期廢棄。近年張亮亮等對海南蒲桃色素的提取及穩定性［11－13］、黃思梅等對海南蒲桃果實原花青素抗氧化活性的穩定性做了一定的研究［14］，本文研究了海南蒲桃果實原花青素的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要儀器

1.1.1 材料來源及預處理

于廣東梅州市采摘果皮顏色褪綠及淡紅色的八成熟海南蒲桃果實，除去過熟、果皮軟化的紫黑色果實以及傷果與雜物等，自來水洗凈、晾干，冷凍干燥，粉碎，80篩目過篩粉末低溫保存備用。

1.1.2 主要試劑

甲醇、無水乙醇、丙酮、正丁醇、濃鹽酸、硫酸鐵銨，均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設備

低速大容量多管離心機(JLL28-B)，上海安亭科學儀器廠;凍干機(BT2K XL)，美國VirTis公司;紫外-可見分光光度計(U-2800)，日本日立公司;酸度計(PHS-2C)，上海滬西分析儀器廠;電子分析天平(FA1604A)，上海精天電子儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原花青素提取效果與含量的測定

原花青素提取液定容后，以正丁醇-鹽酸法加熱顯色、測定各處理液A546值:取1 mL提取液于比色管中，依次加入6 mL體積比為95∶5的正丁醇-鹽酸溶液及0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液，沸水浴40 min，然后迅速冷卻，以蒸餾水代替樣液為參比，測定其A546值。以A546值為衡量提取效果的指標，以文獻［15］公式計算原花青素的含量:

式中:A，吸光度;V，稀釋倍數;m，樣品質量(mg);0.366，在546 nm處原花青素的吸光度。

1.2.2 提取溶劑試驗

準確稱取適量海南蒲桃粉末，分別以不同體積分數的甲醇、乙醇、丙酮及水為提取劑按1∶10(g:mL)的料液比，室溫浸提2 h，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，凍干后蒸餾水定容，得原花青素提取液，同1.2.1測定提取液A546值。

1.2.3 提取時間試驗

準確稱取適量海南蒲桃粉末，以60%丙酮為提取劑，料液比1∶10(g:mL)，室溫浸提至實驗設定時間，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，同1.2.1方法測定提取液A546值。

1.2.4 提取料液比試驗

準確稱取適量海南蒲桃粉末，以不同的料液比體積分數與60%丙酮溶液混合，室溫浸提2 h，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，同1.2.1方法測定提取液A546值。

1.2.5 提取液pH試驗

準確稱取適量海南蒲桃粉末，分別與不同pH值的60%丙酮溶液以料液比1∶10(g:mL)混合，室溫浸提2 h，4 500 r/min離心 20 min，收集上清夜，同1.2.1方法測定提取液A546值。

1.2.6 提取溫度試驗

準確稱取適量海南蒲桃粉末，以料液比1∶10(g:mL)與60%丙酮提取劑混合，于10～70℃ 內恒溫水浴中浸提2 h，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，3次重復，同1.2.1方法測定不同料液比原提取液的吸光度。

1.2.7 提取參數的正交優化

根據單因素試驗，對溶劑濃度、pH值、料液比及提取溫度進行4因素、3水平的正交優化。

1.2.8 不同提取次數原花青素的提取率

以正交試驗獲得的優化參數提取八成熟果實物料原花青素5次，測定不同提取次數海南蒲桃原花青素的吸光度，以5次提取的吸光度總和為100%的提取率，然后計算不同提取次數原花青素的累計提取率。

1.2.9 果實不同成熟度原花青素的含量

八成熟度與充分成熟的海南蒲桃果實，冷凍干燥，粉碎，80篩目過篩，以正交優化所獲參數提取的5次，同前述方法測定提取液A546值，計算原花青素的含量。

1.2.10 處理設置與數據分析

各處理重復3次，試驗數據平均值以excel作圖，用SPSS 11.0進行方差分析，相關數據進行Duncans’差異顯著性分析，P＜0.0 5表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑與濃度提取原花青素的效果

海南蒲桃果實物料以4種溶劑室溫浸提原花青素2 h的相對效果見圖1。從圖1看出甲醇、乙醇及丙酮隨著濃度增加原花青素的提取效果相應提高，達到一定濃度后提取效果又逐漸下降，但無水甲醇、乙醇及丙酮均無明顯的提取作用;60%溶液丙酮浸提的效果為最佳，70%溶液乙醇溶液其次，甲醇溶液的提取效果更差。供試的3種有機溶劑原花青素提取液最大的吸光度間差異極顯著(P＜0.01)。蒸餾水具一定的提取作用，但遠低于含適宜比例有機濃度的提取效果。

圖1 溶劑種類及濃度對原花青素提取的影響

3種有機溶劑原花青素提取效果最佳的溶劑濃度不一。甲醇、丙酮與乙醇溶劑對原花青素提取效果最佳的濃度分別為50%、60%及70%，溶劑使用的濃度越高，提取過程中消耗的溶劑越多，提取費用越大。但因60%丙酮提取的原花青素達50%甲醇溶液的1.55倍，與乙醇相比不僅溶劑消耗量低而且提取的效果好，因而丙酮作為提取溶劑為最適。

2.2 浸提時間與原花青素提取效果的關系

以60% 丙酮溶液為提取溶劑，室溫下不同時間原花青素的浸提效果見圖2。

圖2 浸提時間對原花青素提取的影響

從圖2中可以看出，浸提時間在0.5～2.0 h內，隨提取時間的延長原花青素的溶出量逐漸增加，且2相鄰處理間提取液吸光度的差異顯著(P＜0.05)。浸提時間2.0～5.0 h內提取液原花青素的吸光度存在小幅波動，但彼此間差異不顯著。結果表明，在實驗條件下浸提2.0 h時物料中的原花青素的溶解已基本達到平衡，溶液中原花青素的量已達最大值。

2.3 料液比與原花青素提取效果的關系

海南蒲桃粉末與60%丙酮溶液以不同料液比(質量/體積)混合，浸提2 h后的吸光度見圖3。結果料液比1∶4～1∶9內隨料液比的增加，提取的原花青素量不斷增加，料液比1∶9原花青素的提取量與其它料液比提取的原花青素的差異顯著。結果表明，海南蒲桃原花青素以60%丙酮溶液浸提最適的料液比為 1∶9。

料液比的高低與提取液的極性無關，改變料液比不會改變目的物質在溶液中的溶解度。但料液比的變化影響提取物的濃度與溶劑的使用量，溶劑若是使細胞膜溶解及膠體物質變性而促進目的物質的溶出，則溶劑量越大對細胞膜的破壞作用越大、膠性物質沉淀越徹底，目的物質越容易從胞內擴散至溶液。而且料液比越大，目的物質胞內與胞外的濃度差越大，目的物質由胞內向胞外擴散的速度越快。

圖3 料液比對原花青素提取的影響

2.4 溶液pH值與原花青素提取效果的關系

不同pH值的60%丙酮溶液原花青素的浸提效果見圖4。

圖4 pH值對原花青素提取的影響

由圖4可見，pH=2時，原花青素的提取效果最好，提取液的吸光度分別為pH=1和pH=3提取液的1.16倍及1.67倍，而且與pH=1的差異顯著、pH=3差異極顯著。當提取劑pH＞2時，提取原花青素的效果急劇下降，浸提液在pH在5～9內原花青素提取液吸光度間的差異不顯著。結果表明酸性條件有利于海南蒲桃果核中原花青素的提取，弱酸、中性與強堿條件下對原花青素的提取效果均不佳，結果與原花青素提取相關文獻的報道基本吻合［7］。

2.5 提取溫度對提取效果的影響

不同溫度浸提2 h提取液吸光度測定結果見圖5。

圖5 提取溫度對原花青素提取的影響

結果表明，在50℃下提取對原花青素的提取效果最佳，提取液的吸光度為0.654，與40℃的提取液的吸光度差異極顯著，且與60℃下提取的提取液的吸光度差異顯著。提取溫度若較低，與蛋白質、纖維素等結合的原花青素分離較慢，一定時間內原花青素溶出少，提取效率不高;溫度升高，溶解速度加快，原花青素的提取率升高，而溫度過高可能影響原花青素的穩定性差，聚合度降低、易氧化，得率低。植物活性物質的提取多為50℃左右為宜［13］，也有少量以室溫浸提或沸水提取的報道［16］。

2.6 正交優化實驗

以溶劑濃度、料液比、提取溫度及pH值進行的L9(34)正交結果見表1。由表1可知各種因素對提取效果影響的主次順序依次為料液比＞pH值＞提取溫度＞溶劑濃度。在提取時間為2 h條件下，提取海南蒲桃果實原花青素效果最佳的組合是A2B2C3D1，即提取的最佳參數為丙酮濃度60%、料液比1∶9、提取溶劑pH=3及提取溫度60℃，此提取參數使用的溶劑濃度與溶液的酸度較低，提取時間亦較短，但需要60℃的較高溫度。正交試驗方差分析與顯著性檢驗見表2。由表2可知，料液比對原花青素提取與丙酮濃度、pH值及提取溫度3因子相比的差異在顯著水，而后3者間的差異不顯著。

表1 正交實驗結果

表2 正交實驗方差分析表

2.7 提取次數與原花青素提取率的關系

海南蒲桃果實粉末以正交優化參數進行5次原花青素提取，結果見表3。從表3可以看出，以正交優化的參數進行原花青素提取，經1次提取的提取率為80.42%，2、3次提取的累計提取率分別為91.52%與95.29%，即經3次浸提后殘渣中保留的原花青素甚微。研究表明浸提次數，以2～3次即可。

表3 不同提取次數原花青素的提取率

2.8 海南蒲桃果實原花青素的含量

八成熟與充分成熟的海南蒲桃果實以正交優化參數分別進行5次的原花青素提取后，測定其花青素含量(表4)。結果表明，八成熟的海南蒲桃果實的原花青素含量高，八成熟與充分成熟果實原花青素的含量分別為5.70%和4.48%。而且為充分成熟果實原花青素含量的127.23%，遠高于充分成熟果實內的原花青素含量。

表4 海南蒲桃果實原花青素含量%

3 結論與討論

研究表明從八成熟的海南蒲桃果實提取原花青素宜以體積分數的60%的丙酮水溶液為提取溶劑、pH=3、料液比 1∶9、溫度 60℃、提取時間 2h，經 2 次浸提原花青素提取率91.52%。丙酮溶液提取海南蒲桃原花青素的效果優于乙醇及甲醇溶液，丙酮的酮基易于與原花青素中的羥基以氫鍵形式締合，在水溶液中兩者的氫鍵締合作用較強。文獻報道丙酮為溶劑提取原花青素的最佳濃度多為70% ～80%［17］，而本實驗結果是60%，溶劑消耗更少。

海南蒲桃果實原花青素開發宜以八成熟果實為原料。八成熟海南蒲桃果實原花青素的含量高，而且硬度大，采摘、干燥等中的損耗低。充分成熟果實中的部分原花青素轉化為花青素，并與糖結合形成花色苷［12］，但果實采摘、干燥時的損耗大，原料的利用率低。

海南蒲桃是開發活性產物的重要資源。八成熟海南蒲桃果實原花青素的含量達5.7%，而多數植物材料中原花青素含量不足1%。海南蒲桃是可鮮食的野生水果，果實中原花青素的安全性高。我國華南沿海省區海南蒲桃大量用于城市綠化與水源涵養林，開發海南蒲桃果實原花青素不僅可使資源變廢為寶，而且不影響其園林綠化與水源涵養功能。

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