腦源性神經營養因子在孤獨癥模型鼠顳葉皮層中的表達①

陳淑娟，姜志梅，郭嵐敏，張士嶺，孫奇峰，李麗，王長山

腦源性神經營養因子在孤獨癥模型鼠顳葉皮層中的表達①

陳淑娟1，姜志梅1，郭嵐敏1，張士嶺1，孫奇峰1，李麗2，王長山3

目的研究顳葉皮層腦源性神經營養因子(BDNF)表達與孤獨癥的關系。方法孕12.5 d W istar大鼠腹腔注射丙戊酸鈉(VPA)600mg/kg，觀察仔鼠(VPA組)的行為學特征，應用免疫組化法檢測VPA組與對照仔鼠(對照組，腹腔注射等量生理鹽水)顳葉皮層BDNF表達。結果與對照組相比，VPA組表現為低體重(P＜0.05)，睜眼時間延遲(P＜0.05)，協調性反應差(P＜0.05)，方向趨向性反應遲緩(P＜0.05)；社交行為次數減少(P＜0.05)、潛伏期延長(P＜0.05)、持續時間縮短(P＜0.05)，重復行為增多(P＜0.05)。小腦浦肯野細胞數量減少。出生后1 d、7 d、14 d時，VPA組顳葉皮層BDNF表達明顯高于對照組(P＜0.01)，而出生后35 d、49 d時，VPA組顳葉皮層BDNF表達明顯低于對照組(P＜0.01)。結論顳葉BDNF表達參與孤獨癥的發病過程。

孤獨癥；腦源性神經營養因子；丙戊酸鈉；大鼠

[本文著錄格式]陳淑娟，姜志梅，郭嵐敏，等.腦源性神經營養因子在孤獨癥模型鼠顳葉皮層中的表達[J].中國康復理論與實踐,2012,18(5):426-429.

孤獨癥(autism)又稱自閉癥，是一種嚴重的廣泛性腦發育障礙性疾病。通常3歲以前發病，至今病因未明。顳葉與社會知覺、語言和“心理理論”能力有關，孤獨癥患兒存在上述能力缺陷[1]。顳葉與孤獨癥發病的關系近年來受到廣泛關注。本研究觀察腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在孤獨癥動物模型鼠顳葉皮層中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丙戊酸鈉(VPA)：SIGMA公司；兔抗BDNF抗體(l∶1000)、生物素標記山羊抗兔IgG(即用型)、SABC復合物(即用型)、Cy3-山羊抗兔(l∶200)：武漢博士德生物公司。

1.2 模型制備 健康成年清潔級W istar雄性(體重280～300 g)大鼠30只，雌性(體重220～250 g)大鼠60只，購自大連醫科大學實驗動物中心，飼養于佳木斯大學專用動物房，給予充分飼料和飲水。日光燈維持光照，每天12 h(7:00～19:00)，環境安靜，室溫25℃左右。實驗動物喂養及實驗程序均嚴格遵照佳木斯大學實驗動物保護條款執行。

環境適應2周后，于17:00以雌雄比2∶1合籠，次日8:00查陰道涂片，以查得精子為妊娠第1天，孕鼠另籠飼養。

參照Schneider等的方法[2-4]，在孕12.5 d時，模型組孕鼠(n=50)腹腔注射丙戊酸鈉600mg/kg(丙戊酸鈉粉用生理鹽水配成250mg/m l溶液)；對照組(n=10)孕鼠腹腔注射等量生理鹽水。模型組母鼠產下的仔鼠記為丙戊酸鈉組(VPA組,n=225)，對照組母鼠產下的仔鼠記為生理鹽水組(Con組,n=90)；出生當日記為生后第1天(P1)。

1.3 模型鑒定[2-4]

1.3.1 發育學測試

1.3.1.1 體重 取VPA組和Con組P7、P14、P21、P56和P90雄鼠各10只稱重。

1.3.1.2 睜眼時間測定 取VPA組及Con組鼠各10只，于P12、P13、P14、P15和P16觀察睜眼情況。評分標準：0分：2只眼睛均未睜；1分：1只眼睛睜開；2分：2只眼睛均睜開。

1.3.1.3 方向趨向性檢測(傾斜板試驗) 取VPA組及Con組鼠各10只，于P7、P8、P9、P10觀察方向趨向性情況：將鼠頭朝下放在25°光滑傾斜平面上，觀察鼠轉身180°所用時間。

1.3.1.4 協調性檢測(游泳試驗) 取VPA組及Con組P9、P11、P13和P15鼠各10只，逐個放于28℃恒溫槽中央，觀察5～10 s，根據耳與頭頂部處于水面位置評分：0分：頭頂和鼻在水面以下；1分：鼻在水面以下，頭頂在水面以上；2分：鼻和頭頂在水面以上或與水面平齊，雙耳在水面以下；3分：鼻和頭頂位置與2分標準相同，但水位線在耳中間；4分：鼻和頭頂位置與2分標準相同，水位線在耳以下。

1.3.2 行為學檢測

1.3.2.1 社會交往行為檢測 于P35時檢測。從兩組仔鼠中分別選擇被測鼠和搭檔鼠各6只，兩者之間組別、月齡、性別相同，體重差別≤15 g，分籠飼養。檢測在規格為60×60×60 cm曠場箱內進行。實驗前2 d，所有鼠被單獨放在曠場箱內，每次5m in，每天2次，連續2 d，以減輕對新環境的焦慮。實驗前1 h隔離被測鼠。被測鼠和搭檔鼠隨機配對，共同置于曠場箱中10m in，播放背景音樂。記錄社會行為潛伏期(從進入曠場到出現社交行為的時間)、10m in內社會行為次數、每次社會行為持續時間。社交行為包括：一只鼠緊跟同伴保持同步、鼻-鼻嗅探(嗅同伴鼻子和臉)、推擠爬行(與同伴身體接觸，包括在同伴身體下推擠，在同伴和墻壁或地板之間推擠，爬過同伴的身體或在其身體之下)和給同伴理毛。非社交行為包括自我理毛和區域探測(繞著某一區域走，嗅探或挖墊草)。

1.3.2.2 重復行為檢測 重復行為是指一系列行為以正常模式出現，但持續時間異常[5]。于P21、P35、P49時VPA組和Con組各取10只在干凈曠場中進行，每只鼠先適應環境10m in，然后記錄10m in內鼠用于整理身體所有部位毛的累積時間。播放背景音樂。由2位觀察員用2塊秒表同時觀看錄像記時，取平均值。

1.3.3 形態學檢測 取VPA組和Con組P14、P21、P35、P49鼠各5只，制備Nissl染色標本切片。每只取5張小腦切片，應用Olym Pus顯微鏡及圖像分析系統，對小腦浦肯野細胞數量進行分析。每張切片隨機選5個視野，取平均值。

1.4 免疫組化檢測 取VPA組和Con組P7、P14、P21、P35、P49鼠各5只麻醉，開胸，從心耳部灌洗后迅速斷頭取腦，置中性甲醛中固定，石蠟包埋，切片厚20μm，每只取6張，5張采用SABC法行顳葉皮層BDNF免疫組織化學染色，1張用PBS代替一抗做陰性對照。應用Olympus顯微鏡及圖像分析系統測定積分光密度(IOD)。每張切片隨機選5個視野，取平均值。

1.5 統計學分析 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，所有數據均用(±s)表示，兩組均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 發育

2.1.1 體重 P7、P14時，VPA組鼠體重與Con組無顯著性差異(P＞0.05)；P21、P56、P90時，VPA組體重低于Con組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組體重比較(g)

2.1.2 睜眼時間 P12、P13、P14時，VPA組鼠睜眼時間評分較Con組低(P＜0.05)；P15時，兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。P16時及以后，兩組鼠均完全睜眼。見表2。

2.1.3 方向趨向性 與Con組比較，各時間點VPA組鼠轉身所用時間均長(P＜0.05)。見表3。

2.1.4 協調性反應 與Con組比較，P9、P11、P13時VPA組鼠評分低(P＜0.05)；P15時，兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

表2 各組睜眼情況評分比較

表3 各組轉身時間比較(s)

表4 各組游泳評分比較

2.2 行為

2.2.1 社會交往行為 與Con組比較，VPA組鼠社交行為次數減少(P＜0.05)，社會行為潛伏期顯著增加(P＜0.001)，社交行為持續時間縮短(P＜0.05)。見表5。

表5 不同組社會交往行為比較

2.2.2 重復行為 與Con組相比較，P21、P35、P49時VPA組鼠理毛行為累積時間增多(P＜0.001)。見表6。

表6 各組理毛行為累積時間比較(s)

2.3 形態學 P14、P21時，VPA組鼠小腦浦肯野細胞數與Con組無顯著性差異(P＞0.05)；P35、P49時，VPA組鼠小腦浦肯野細胞數減少(P＜0.05)。見表7。

2.4 BDNF表達 P1、P7、P14時，VPA組鼠顳葉皮層IOD值明顯高于Con組對應部位IOD值(P＜0.01)；P35、P49時，VPA組IOD值明顯低于Con組(P＜ 0.01)。見表8。

表7 各組小腦浦肯野細胞數比較

3 討論

瑞典研究顯示，約30%孤獨癥兒童母親在妊娠20～24 d有應用鎮靜劑史[6-7]。丙戊酸鈉可能通過促進膠質細胞凋亡，減少小腦浦肯野細胞，降低內啡肽和增加5-羥色胺等機制導致孤獨癥[8]。本研究VPA組鼠表現的發育落后、行為異常和形態學異常，支持丙戊酸鈉致孤獨癥鼠模型的有效性。

顳葉皮質功能異常與孤獨癥發病密切相關。黨桂娟等采用單光子發射斷層掃描(SPECT)進行腦血流灌注顯像，研究顯示83%孤獨癥患者腦血流灌注降低，其中78%的病灶在顳葉、頂枕葉及海馬回、扣帶回等邊緣系統[9]。Goldberg等利用磁共振成像平面回波序列的血氧水平依賴技術(BOLD-fMRI)，顯示孤獨癥患兒左側顳上回信號增強[10]。Nelson等應用免疫親和層析法對新生兒時保存的血液樣品研究發現，與正常對照組相比，孤獨癥組新生兒血液樣品中BDNF水平較高，認為BDNF高水平表達反映了區域代償機制或者是孤獨癥發病過程的一個組成部分[11]。這一結果與本研究出生后1 d、7 d(相當于新生兒)結果一致。

BDNF參與BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡通路。我們推測，BDNF高表達可能是一種保護反應，這種自我保護反應可能與孤獨癥典型癥狀在嬰幼兒期表現不明顯有關。Sheikh等研究發現，孤獨癥患者大腦中BDNF水平下降，導致調節Bcl-2的Akt激酶表達和磷酸化下降[12]，表明BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡信號通路下調是導致孤獨癥發病的一個潛在機制。

出生后35 d，與正常組相比，孤獨癥組BDNF表達降低，BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡通路下調，導致膠質細胞凋亡增加。膠質細胞是神經系統的支架，其凋亡增加使神經纖維難以遠程遷移，可解釋孤獨癥的社交互動損害；神經纖維只在局部反復聯系，可解釋孤獨癥的重復行為[8]。

BDNF生物作用廣泛，是大腦發育和功能的基礎。本研究結果表明，顳葉BDNF表達可能參與孤獨癥的發病過程。對于其具體發病途徑，還需要在后續實驗中對其信號轉導通路進行研究。另外，是否可以通過測定BDNF水平來進行孤獨癥早期診斷，或者BDNF水平是否可作為繼續發展為孤獨癥的一個標志，還需大量基礎及臨床試驗進行驗證。

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第24屆全國脊柱脊髓學術會議征文通知

由中國殘疾人康復協會脊髓損傷康復專業委員會、國際脊髓學會中國脊髓損傷學會主辦，吉林大學中日聯誼醫院承辦的第24屆全國脊柱脊髓學術會議將于2012年8月3日～6日在吉林省長春市舉行。會議交流形式分為大會發言和展板專題討論。屆時將有歐美、亞太地區、中國大陸及港、澳、臺地區的著名專家為大會作學術報告，推出最新基礎研究和臨床成果及學術動態等。歡迎骨科脊柱外科、康復醫學科、神經學科、泌尿外科、中醫科、腫瘤科、放射科及相關基礎研究領域的同仁踴躍參加并積極投稿。

參會或投稿請登錄會議網站（http://www.cscc5413.com）辦理投稿、注冊和預約參會等事宜。會議注冊費：1200元/人；7月3日前網上注冊優惠價1000元/人；學生憑學生證注冊費600元/人。授予中國醫院協會繼續醫學教育Ⅰ類學分3分。

征文要求：尚未在國家級以上學術會議交流或國內外雜志上公開發表；800字左右文章摘要，w ord文檔，宋體，標題四號字，正文五號字。論文應具有先進性、科學性和實用性，論點鮮明、結構嚴謹、真實可靠；投稿格式：包括中文題目、作者、單位、中文摘要（目的、方法、結果、結論）、關鍵詞，同時應附作者的聯系地址、郵編、聯系電話及E-mail地址；如大會安排發言需補充英文摘要；投稿方式采用網上注冊投稿，并注明是否參會，以便安排發言；截稿日期：2012年7月1日，逾期不予受理，優秀論文可推薦在《中國康復理論與實踐》雜志發表。

特別提示：請通過會議網站進行網上注冊、投稿及住宿選擇，不接受紙質稿件。會議地點：長春國際會展中心大飯店(長春市經濟開發區會展大街100號)。聯系人：楊玉輝 13804314436；許卓 15043075688；電子郵件（E-mail）：yangyuhuime@163.com。

Exp ression of Brain-derived Neurotrophic Factor in Tem poral Cortex of Autism M odel Rats

CHEN Shu-juan,JIANG Zhi-mei,GUO Lan-min,etal.DepartmentofChild Developmentand Behavior,the Third Affiliated Hospital,Children Neurological Rehabilitation Lab,JiamusiUniversity,Jiamusi154003,Heilongjiang,China

Ob jectiveTo explore the role of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in pathogenesis of autism.M ethods12.5 d pregnantW istar rats were injected sodium valproate(VPA)600 mg/kg or normal saline(NS).Their newborn rats were observed ethologically. The expression of BDNF wasmeasured in their tem poral cortex with immunohistochem ical stain.Resu ltsCompared with NS group,VPA group expressed less body mass(P＜0.05),eyes opening delay(P＜0.05),poorer coordination response(P＜0.05),slower taxis response(P＜0.05).The number of social behavior decreased(P＜0.05),latency increased(P＜0.05),duration shortened(P＜0.05),repetitive activities increased(P＜0.05).Purkinje cells reduced in cerebellum.The expression of BDNF increased significantly in temporal cortex 1 d,7 d and 14 d postnatally(P＜0.01),butdecreased 35 d and 49 d postnatally(P＜0.01).ConclusionBDNF playsa role in the pathogenesisof autism.

autism;brain-derived neurotrophic factor;sodium valproate;rats

R749.94

A

1006-9771(2012)05-0426-04

2012-01-06)

佳木斯大學研究生創新科研項目(YJSCX 2011-018JD)。

1.佳木斯大學兒童神經康復實驗室，佳木斯大學第三附屬醫院，黑龍江佳木斯市154003；2.佳木斯大學第一附屬醫院兒科，黑龍江佳木斯市154003；3.佳木斯大學基礎醫學院生物教研室，黑龍江佳木斯市154003。作者簡介：陳淑娟(1984-)，女，山東臨沂市人，碩士研究生，主要研究方向：腦發育與行為障礙研究。通訊作者：姜志梅。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.009