固態發酵生產蜜環菌飲料*

肖嫩群，劉洪娜，張華玲，曾奧，郭抗蕭，陳海強，譚周進

1(湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙，410208)

2(湖南中醫藥大學醫學院，湖南長沙，410208)

3(湖南省食用菌研究所，湖南長沙，410013)

固態發酵生產蜜環菌飲料*

肖嫩群1，劉洪娜2，張華玲2，曾奧2，郭抗蕭2，陳海強3，譚周進2

1(湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙，410208)

2(湖南中醫藥大學醫學院，湖南長沙，410208)

3(湖南省食用菌研究所，湖南長沙，410013)

以蜜環菌固態發酵物為原料制得一種蜜環菌飲料。以蜜環菌固態發酵物為原料，提取其中的多糖等營養和藥效成分，進行風味調配，通過正交試驗和感官評價的方法確定蜜環菌飲料的配方。該發酵飲料的培養基配方為:白砂糖1.5%，大米80%，黃豆1%，麩皮10%，紅薯7.5%;飲料配方為:蜜環菌發酵液添加比例為30%、白砂糖為20 g/L、檸檬酸0.6 g/L、黃原膠0.2 g/L，測得成品飲料中各成分的含量為:多糖0.049 mg/mL，還原糖0.042 mg/mL，蛋白質53.0 mg/mL，氨基酸1.226 mg/mL。飲料的感官指標、理化指標和微生物指標均達國家標準。

蜜環菌飲料，多糖，食藥用菌，固態發酵

蜜環菌(Armillariella mellea)是一種著名的藥食兼用真菌[1］，菌體中富含多種生理活性物質，其所含多糖具有抗輻射、促進造血機能、調節免疫功能、抑制腫瘤生長等藥理和保健功能[2］。蜜環菌富含多糖﹑粗纖維及多種人體必需的氨基酸，是一種營養價值很高的食品。國內外已有將蜜環菌開發成產品的相關報道，開發出腦心舒口服液、健腦露、蜜環菌浸膏、蜜環菌片和蜜環菌糖漿等多種蜜環菌制劑和產品[3］。

固態發酵具有投資少、能耗低等優點。本研究以蜜環菌固態發酵物為原料，制作蜜環菌營養保健飲料，充分利用蜜環菌發酵后的有效成分，配制工藝簡單，成本低廉，為保護和人工開發真菌資源開辟新的途徑，具有較好的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料

蜜環菌(由課題組從天麻中分離保存)、白砂糖、檸檬酸、黃原膠、苯甲酸鈉、苯酚、濃硫酸、乙醇、無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、丙三醇、牛血清白蛋白、磷酸、考馬斯亮藍-G250、酚酞、甲醛。

1.2 培養基

(1)斜面培養基:土豆20 g、葡萄糖2 g、KH2PO40.3 g、MgSO40.15 g、瓊脂1.6～1.8 g，水100 mL，pH 6.5;121℃滅菌30 min。

(2)固態發酵培養基:采用5種不同培養基配方，首先按量稱取各種配料，拌勻，清水拌濕，悶放約30 min，含水量達到70%～80%為宜，即手輕捏指縫間有水，滴出2～3滴為度。配方見表1。

表1 培養基配方(均為質量分數/%)

1.3 儀器

PL203電子天平，瑞士梅特勒;S.SW-CJ-1BU超凈工作臺，上海滬粵明科學儀器有限公司;DR9082電熱恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司;HH-6恒溫水浴鍋，常州恒德儀器制造有限公司;7012S/7012G組織搗碎機，北京德泉興業商貿有限公司;YXQ-SG46-280S高壓蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司;722S分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.4 工藝流程

蜜環菌→活化→固態發酵→組織搗碎→熱水浸提→4層紗布過濾→風味調配裝瓶→滅菌→理化及微生物指標檢[4］

1.5 操作要點

1.5.1 蜜環菌菌種活化

蜜環菌在無菌條件下用接種針挑取菌絲片段接種于斜面，27℃恒溫培養，直至蜜環菌長滿整個試管為止。

1.5.2 固態發酵培養

挑取斜面菌種，無菌操作分別接種到上述5種配方的固態培養基中，27℃恒溫培養箱中培養，觀察并記錄各種培養基中蜜環菌的生長狀況，包括開始萌發時間、生長的快慢及蜜環菌菌絲量等[5-6］。

1.5.3 組織搗碎及有效成分浸提

首先將固態發酵得到的蜜環菌稱重，按質量比1∶5的比例加入水，一起倒入組織勻漿機中，打碎成漿液。勻漿后的發酵漿液置于60℃水浴鍋中浸提30 min，以促使菌絲體自溶，有利于較多的營養物質溶于其中，然后用4層紗布分離并過濾，得到發酵勻漿濾液，如果濾液不夠澄清可進行二次過濾。

1.5.4 調配

選取蜜環菌發酵液、砂糖、檸檬酸、黃原膠添加量4因素，進行4因素3水平的正交試驗，配方設計如表2所示。

表2 正交試驗因素與水平表

1.5.5 分裝、殺菌、冷卻

將調制好的產品分裝到飲料瓶中，置于90℃水浴鍋中滅菌30 min，自然冷卻即為成品。

1.6 產品感官及評分標準[7-8］

由10人組成評定小組，按評定標準進行綜合評定，去除最高分和最低分后，計算出平均分作為該樣品的感官評分。評定標準:從色澤、氣味、組織形態3個方面進行評分，總分為100分，其感官質量指標評分細則見表3。

表3 感官評分標準

1.7 成品飲料的微生物學指標檢測[9］

1.7.1 菌落總數的測定

①梯度稀釋液制備:以無菌操作制備蜜環菌飲料10倍遞增稀釋液②傾注培養:根據標準要求或對污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，本實驗檢測10-1、10-2、10-3三個稀釋度，取1 mL稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。將涼至46℃營養瓊脂培養基注入平皿約15 mL，并轉動平皿，混合均勻。同時將營養瓊脂培養基傾入加有1 mL稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉平板，置(36±1)℃溫箱內培養(48±2)h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得1 mL樣品所含菌落總數。

1.7.2 大腸菌群數的測定

具體操作參見GB4789.3-1994《中華人民共和國國家標準食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定》。

1.8 成品飲料中各成分含量的測定

1.8.1 多糖測定

采用苯酚-硫酸法[10-11］。首先將離心分離得到的濾液濃縮，加入3倍體積的75%的乙醇溶液沉淀過夜，3000 r/min離心15 min，得到的沉淀用75%的乙醇洗至無還原糖反應，再離心得到粗多糖，將離心得到的粗多糖溶于一定量的熱水中，在490 nm的波長處比色測定吸光度。

1.8.2 還原糖測定

DNS法。吸取2 mL樣液(可稀釋適當倍數)，置于25 mL容量瓶中，再加入3，5-二硝基水楊酸溶液3 mL，沸水顯色5min，然后以流水迅速冷卻，用水定容至25 mL，搖勻，以試劑空白調零，在540nm處比色求出還原糖的量。

1.8.3 蛋白質測定

采用考馬斯亮藍G-250法[12］。取1支具塞試管，準確加入0.1 mL樣品提取液，再加入0.9 mL蒸餾水，5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2 min后，在595 nm波長下比色，記錄吸光度。根據所測樣品提取液的吸光度計算蛋白質含量(μg)。

1.8.4 氨基酸測定

甲醛滴定法。

2 結果

2.1 蜜環菌固體發酵培養基

蜜環菌在不同培養基上的生長情況有較大差異，結果見表4?？梢钥闯?，蜜環菌在A、B、D三種培養基中均能生長，且B培養基中的蜜環菌在接種10 d左右后最先開始萌發，菌索生長的最快，生長狀況最佳，大約45 d左右最先長滿整個培養基。A、D培養基中的蜜環菌萌發的時間較晚，生長較慢。C中萌發時間最晚，且菌絲體幾乎不長，可能是培養基中缺少蜜環菌生長所需的營養物質，而在E培養基中菌絲生長緩慢，且一段時間整個培養基開始變黑。由此確定培養基的最佳配方為B(白砂糖1.5%，大米80%，黃豆1%，麩皮10%，紅薯7.5%)。

表4 蜜環菌在不同培養基上的生長情況

2.2 飲料配比的確定

為優化蜜環菌飲料的風味，本試驗按4因素3水平正交試驗表進行試驗設計，分別以蜜環菌發酵液(A)，糖度(B)，酸度(C)，黃原膠(D)為4個試驗因素，得到9個配方組合;并以10人的評審小組，按照感官評分標準，對調配樣品進行品評，以感官指標總分為指標，對各處理的蜜環菌飲料的進行綜合評價，確定最佳配方。配方的正交試驗見表5。

表5 正交試驗結果表

由正交表5可知，按級差(R)大小，影響感官指標總分的各因素的主次順序分別為A＞D＞B＞C，即發酵液比例＞黃原膠＞砂糖＞檸檬酸。根據各水平下K1、K2、K3確定各因素的最優水平組合為:A3B3C1D3，即蜜環菌發酵液添加比例為30%、白砂糖為20 g/L、檸檬酸0.6 g/L、黃原膠0.2 g/L時，蜜環菌飲料酸甜適中，具有較濃郁的菌香味，且香氣純正口感協調柔和風味較佳。當發酵液的添加量為10%時，蜜環菌飲料香味較淡，幾乎聞不到菌香;當發酵液的添加量為20%時，飲料菌香有所增加，但菌香不夠濃郁;當發酵液的添加量達到30%時，飲料有較濃郁的菌香，口感純正無其他異味。白砂糖的添加量為10 g/L時，飲料口味偏淡。白砂糖添加量20 g/L，檸檬酸的添加量為0.6 g/L時產品酸甜適中，當黃原膠的添加量為0.15 g/L時，飲料不穩定有沉淀產生，黃原膠添加到0.2 g/L時，飲料較為穩定，幾乎無沉淀。

2.3 飲料微生物指標的檢測結果

按照GB/T 4789.3-2003進行成品飲料的微生物學檢測，結果表明，飲料中細菌總數小于10 CFU/mL，大腸菌群數不超過3個/100 mL，致病菌未檢出，表明該飲料符合國家衛生標準。

2.4 飲料中各成分含量測定結果

經測定，飲料中多糖的含量為0.049 mg/L，還原糖的含量為0.042 mg/L，蛋白質的含量為53.0 mg/L，氨基酸的含量為1.226 mg/L。

3 結論

(1)蜜環菌固態發酵培養基配方為:白砂糖1.5%，大米80%，黃豆1%，麩皮10%，紅薯7.5%。

(2)固態發酵蜜環菌所用原料一般為經濟易得、富含營養物質的工農業副、廢產品，如麩皮、薯粉、大豆餅粉、高粱、玉米粉等，而且固態發酵一般采用開放式，所需設備簡單，易于操作，具有較廣闊的市場前景[13］。

(3)本試驗是采用蜜環菌固體發酵物經組織搗碎，將發酵物中菌絲體碎成槳，提取其中多糖等營養和藥效成分而配制飲料，大大提高了飲料的營養及藥理功效。

(4)飲料中含有較多的營養物質，如氨基酸、多糖等。

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ABSTRACTStudy on the method using solid fermentation as raw material for health beverage.Armillaria mellea fermentation solid was used as raw material to extract the polysaccharide and other nutritional and medicinal components.After flavor adjustment，the optimum formula of the beverage of armillaria was determined through orthogonal test and sensory evaluation method.The optimizing solid fermentation medium for Armillaria mellea contained sugar 1.5%，rice 80%，soybean 1%，bran 10%，sweet potato 7.5%.The best formula for beverage was as follows:30%armillaria fermented liquid，20 g/L sugar，0.6 g/L citric acid，and 0.2 g/L xanthan gum.The ingredients of the finished product drink were as follows:0.049 mg/mL polysaccharide，0.042 mg/mL reducing sugar，53.0 mg/mL protein，and 1.226 mg/mL amino acid.The senses index，physical and chemical indexes and microbiology indicators of drink have reached national standards.The Armillaria mellea beverage has unique taste and function for health care，it has great value in utilization.

Key wordsArmillaria mellea beverage，polysaccharide，edible fungi，solid fermentation

Studies on Armillaria mellea Beverage Produced by Solid Fermentation

Xiao Nen-qun1，Liu Hong-na2，Zhang Hua-ling2，Zeng Ao2，
Guo Kang-Xiao2，Chen Hai-Qiang3，Tan Zhou-Jin2
1(School of Pharmaceutical Sciences，TCM University of Hunan，Changsha 410208，China)
2(School of Medicine，TCM University of Hunan，Changsha 410208，China)
3(Hunan Domestic Fungus Research Institute，Changsha 410013，China)

碩士，實驗師(譚周進教授為通訊作者，E-mail:tanzhjin@sohu.com)。

*長沙市科技局項目(No.k0803270-31);“十一五”國家科技支撐計劃課題(No.2008BADAIB07);湖南省中醫藥管理局課題(2010110)

2012-03-01，改回日期:2012-06-03