凝血因子ⅦR353Q基因多態性與中國漢族兒童腦性癱瘓的相關性研究①

李曉捷，徐磊，康貝貝

凝血因子ⅦR353Q基因多態性與中國漢族兒童腦性癱瘓的相關性研究①

李曉捷1,2，徐磊1,2，康貝貝1

目的探討凝血因子ⅦR353Q基因多態性與中國漢族兒童腦癱的關系。方法應用聚合酶鏈反應與限制性片斷長度多態性分析方法對160例腦癱患兒和137名正常兒童的凝血因子ⅦR353Q基因型和等位基因進行測定。結果腦癱組和對照組人群凝血因子ⅦR353Q基因型分布符合Hardy-weinberg平衡定律(P＞0.05)，兩組凝血因子ⅦR353Q基因型(P=0.436)和等位基因分布無顯著性差異(P=0.182)。結論凝血因子ⅦR353Q基因多態性不是中國漢族兒童腦癱發病的遺傳易感因子。

腦性癱瘓；漢族；凝血因子ⅦR353Q；基因多態性

[本文著錄格式]李曉捷，徐磊，康貝貝.凝血因子ⅦR353Q基因多態性與中國漢族兒童腦性癱瘓的相關性研究[J].中國康復理論與實踐,2013,19(9):878-880.

腦癱是自受孕開始至嬰兒期的非進行性腦損傷和發育缺陷所導致的綜合征，主要表現為運動發育障礙及姿勢異常[1]。腦癱的發病率在世界范圍內約為1.5‰～4‰，平均約2‰[2]；我國約為1.8‰～4‰[3]。

凝血因子ⅦR353Q基因位于13號染色體長臂上，其基因多態性會對凝血因子Ⅶ活性產生不同程度的影響。近年來國外文獻關于凝血因子ⅦR353Q基因多態性與腦癱發生的相關性報道存在爭議[4-5]。本研究采用聚合酶鏈式反應與限制性片斷長度多態性(polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism, PCR-RFLP)分析方法，對凝血因子Ⅶ基因第8外顯子的R353Q基因多態性進行檢測，探討R353Q基因多態性與腦癱發病的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年3月～2013年1月在佳木斯大學附屬第三醫院門診或住院的腦癱患兒160例，其中男性82例，女性78例；年齡1.13～12.35歲，平均(3.47±2.54)歲，均為漢族。診斷均符合2006年長沙第二屆全國兒童康復學術會議標準[6]，除外單純精神發育遲滯、中樞神經系統感染性疾病、注意缺陷多動障礙、癲癇、已確診為染色體異?；蚱渌窠浵到y器質性疾病患兒。選擇佳木斯市幼兒園和小學就讀的健康兒童137名為對照組，其中男性70名，女性67名；年齡1.47～12.55歲，平均(4.48±2.59)歲，均為漢族。所有參與研究者的監護人均簽署知情同意書。

1.2 R353Q基因多態性檢測

采集靜脈血2 ml，加EDTA抗凝劑后保存于-80°冰箱中。用全血DNA提取試劑盒(大連寶生物公司)提取DNA，置-80°冰箱保存。

PCR擴增采用PCR-RFLP法，特異性擴增R353Q基因序列，產物片段為312 bp。引物序列如下：

上游：5'-GGG AGA CTC CCC AAA TAT CAC-3'，

下游：5'-ACG CAG CCT TGG CTT TCT CTC-3'，

由Invitrogen公司合成。

PCR反應體系：總體積20 μl，其中模板DNA 0.5 ng、引物(10 pmol/L)各0.4 μl、dNTP(各2.5 mmol/L) 1.6 μl、10×PCR buffer 2 μl，金牌Taq酶0.5 U，加入雙蒸水至20 μl。

反應條件：95℃預變性10 min，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環，最后72℃延伸8 min。

取PCR產物8 μl，HhaⅠ1 μl、酶解反應緩沖液2 μl，蒸餾水9 μl，總反應體系20 μl，于37℃水浴4 h；取酶切產物20 μl，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠500 V電泳1 h，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察。

1.3 統計學分析

實驗數據采用SPSS 18.0統計軟件進行分析。組間基因型及等位基因分布采用χ2檢驗，基因型及等位基因與疾病關系的關聯強度OR值其95%CI估計；按Hardy-Weinberg平衡定律進行群體平衡驗證。

2 結果

2.1 電泳結果和基因型分析

R353Q多態性擴增片段大小為312 bp。經限制性內切酶消化可產生3種基因型：當基因型為RR型時，可被酶切成205 bp、67 bp、40 bp三個片段；當基因型為RQ型時，可被酶切為272 bp、205 bp、67 bp、40 bp四個片段；當基因型為QQ型時，可被酶切為272 bp、67 bp、40 bp三個片段。由于40 bp、67 bp片斷太小，電泳時不可見。見圖1。

圖1 R353Q基因酶切產物瓊脂糖電泳結果

2.2 R353Q多態分布

經χ2檢驗，腦癱組和對照組人群R353Q基因型分布符合Hardy-weinberg平衡(P＞0.05)。見表1。

兩組間三種基因型及R和Q等位基因分布均無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 兩組R353Q多態分布的Hardy-Weinberg檢驗(n)

表2 兩組R353Q基因型及其等位基因分布

3 討論

據腦癱研究登記(Cerebral Palsy Research Registry, CPRR)最新報道，美國約有76.4萬名腦癱患者，每年大約有8000名嬰幼兒被診斷為腦癱[7]。傳統觀點認為，圍產期原因是導致腦癱的主要原因；近來認為，70%～80%的腦癱發生于出生前[8]，其中相當大的比例原因不明。因此，近年認為對腦癱病因學的研究應轉入胚胎發育生物學的范疇。盡管圍生醫學迅速發展，足月腦癱兒的發生率并沒有降低[9]，這使得人們越來越重視遺傳因素在腦癱中的意義。Lang等對亞洲腦癱患兒的病例資料研究發現，腦癱病因中，遺傳因素可占到40%[10]。遺傳因素可能決定神經損傷的嚴重程度、預后及臨床表現[11]。

凝血因子Ⅶ基因定位于13號染色體長臂(13q)，目前認為，位于第8外顯子的R353Q堿基變異最為常見；R353Q基因的多態性會對凝血因子Ⅶ活性產生不同程度的影響。目前研究認為，凝血因子Ⅶ可能是缺血性腦血管病的危險因素。Hanson等研究發現，血漿凝血因子Ⅶc水平升高是缺血性腦血管病發病的風險因素，而血漿凝血因子Ⅶc水平與R353Q基因型緊密相關：RR基因型患者最高，RQ基因型次之，QQ基因型最低[12]。

本研究顯示，R353Q基因多態性與中國漢族兒童腦癱的發病無顯著相關性，不是腦癱發病的遺傳易感因子。但這并不排除上述位點在腦癱發病中與其他危險因子可能具有協同作用，從而導致腦癱。此外，R353Q基因多態性與腦癱的關系是否受到性別、地區、民族等因素的影響，還值得我們進一步研究。Adams等發現，母親和胎兒的基因型可能共同決定懷孕時間，與早產的發生有關，進而導致不同程度腦損傷，從而引起腦癱[13]。

[1]李曉捷.實用小兒腦性癱瘓康復治療技術[M].北京:人民衛生出版社,2009.

[2]Morris C.Definition and classification of cerebral palsy：a historical perspective[J].Dev Med Child Neurol Suppl,2007, 109:3-7.

[3]李樹春.小兒腦性癱瘓[M].鄭州:河南科學技術出版社,2000.

[4]Malhotra A,Veldman A.Recombinant activated Factor VII for prevention and treatment of intraventricular haemorrhage in neonates[J].The Cochrane Library,2011-03-16.DOI:10.1002/ 14651858.CD009032.

[5]Nelson KB,Dambrosia JM,Iovannisci DM,et al.Genetic polymorphisms and cerebral palsy in very preterm infants[J].Pediatr Res,2005,57(4):494-499.

[6]陳秀潔,李樹春.小兒腦性癱瘓的定義、分型和診斷條件[J].中華物理醫學與康復雜志,2007,29(5):309.

[7]腦癱研究登記網.https://www.cpregistry.org/index.php

[8]Senbil N,Yüksel D,Yilmaz D,et al.Prothrombotic risk factors in children with hemiplegic cerebral palsy[J].Pediatr Int, 2007,49(5):600-602.

[9]Wanigasinghe J,Reid SM,Mackay MT,et al.Epilepsy in hemiplegiccerebralpalsy due to perinatalarterialischaemic stroke[J].Dev Med Child Neurol,2010,52(11):1021-1027.

[10]Lang TC,Fuentes-Afflick E,Gilbert WM,et al.Cerebral palsy among asian ethnic subgroups[J].Pediatrics,2012,129(4): e992-e998.

[11]Wright A.Neurogenetics II:complex disorders[J].Neurol Neurosurg Psychiatr,2005,76(5):623-631.

[12]Hanson E,Kanse SM,Joshi A,et al.Plasma factor VII－activating protease antigen levels and activity are increased in ischemic stroke[J].J Thromb Haemost,2012,10(5):848-856.

[13]Adams KM,Eschenbach DA.The genetic contribution towards preterm delivery[J].Semin Fetal Neonatal Med,2004,9 (6):445-452.

Relationship between Gene Polymorphism of Factor VII R353Q and Cerebral Palsy for Han Chinese Children

LI Xiao-jie,XU Lei, KANG Bei-bei.Rehabilitation Medicine College of Jiamusi University,Children Neural Rehabilitation laboratory of Jiamusi University,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

ObjectiveTo investigate the relationship between gene polymorphism of factor VII R353Q(FVII R353Q)and cerebral palsy for Han Chinese children.MethodsPolymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism were used to determine genotype and allele of R353Q gene in 160 children with cerebral palsy and 137 normal children.ResultsThe genotype of FVII R353Q is close to Hardy-Weinberg equilibrium in both CP group and control group(P＞0.05).There was not significant difference in the distribution of the allelic frequency and genotype of FVII R353Q between the both groups(P=0.436,P=0.182,respectively).ConclusionThe gene polymorphism of FVII R353Q is not significantly related with cerebral palsy for Han Chinese children.

cerebral palsy;Han;factor VII R353Q;gene polymorphism

R742.3

A

1006-9771(2013)09-0878-03

2013-04-26

2013-05-27)

1.黑龍江省研究生創新科研資金項目(No.YJSCX2012-358HLJ)；2.佳木斯大學科學技術面上項目(No.L2012-032)。

1.佳木斯大學康復醫學院，黑龍江佳木斯市154002；2.佳木斯大學兒童神經康復實驗室，黑龍江佳木斯市154002。作者簡介：李曉捷(1951-)，女，黑龍江延壽縣人，主任醫師，教授，主要從事小兒腦損傷發病機制及早期防治研究。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.09.023