PCR-Targeting體系構建棒狀鏈霉菌基因突變株

左志晗，鄭津輝，趙海龍，李玉珊

(天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津，300387)

棒狀鏈霉菌可產生多種抗生素，如異青霉素N、去乙?；蠕h霉素C、頭霉素C、克拉維酸和棒烷類衍生物等。其中，克拉維酸本身的抗菌活性很弱，但它具有強力廣譜且不可逆的 β-內酰胺酶抑制活性［1］，使其成為臨床上治療耐藥細菌性疾病的主要方法之一。但我國長期以來使用的克拉維酸復方制劑主要依靠進口產品，究其原因是我國目前沒有好的適合于工業化生產的克拉維酸高產菌株，并且后期克拉維酸的分離提取工藝相對落后［2］。

由于克拉維酸的生物合成受到某些基因的級聯調控，故某些調控基因的變化可能會使克拉維酸產量獲得顯著提高［3］，隨著對克拉維酸生物合成途徑研究的不斷深入，采用基因工程的方法構建棒狀鏈霉菌的克拉維酸高產突變株越來越受到各國學者的廣泛關注?？死S酸合成基因簇和頭霉素C合成基因簇相鄰，且受相同的調節蛋白CcaR的調控，研究表明，在發酵過程中降低或消除棒狀鏈霉菌中頭霉素C的合成能夠提高克拉維酸的產量［4］，并可以有效減少發酵液中的干擾物質，簡化提取工藝，對工業上克拉維酸的生產具有重要意義。

本課題組曾采用插入突變的方法成功構建了棒狀鏈霉菌lat基因的突變菌株，結果突變株的克拉維酸產量較原始菌株提高了1.3倍［5］，本實驗仍然從影響棒狀鏈霉菌克拉維酸代謝的頭霉素C的早期合成基因lat入手，采用PCR-Targeting體系對S.clavuligerus的lat基因進行了突變。PCR-Targeting是2002年由Gust和Kieser等人［6］創建的，用于突變鏈霉菌中的野生型基因。該體系中的λRED(gam，bet，exo)功能啟動子能夠極大地提高線性DNA的重組率，使得胞內重組酶BCD、外切核酸酶分解線狀DNA，導致重組率低的問題得以解決。采用該體系最終構建得到了lat基因被敲除的無抗性標記的突變菌株S.clavuligerus lat::scar，其克拉維酸產量最高達到了出發菌株的2.83倍。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

菌株:克拉維酸產生菌棒狀鏈霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585，由沈陽藥科大學何建勇教授惠贈;大腸桿菌 E.coli DH5α 和 E.coli ET12567，E.coli BW25113/pIJ790均為本實驗室保存菌種。

質粒:pIJ773，提供阿泊拉抗性模板質粒，在其抗性基因兩側包含轉移復制起始點oriT以及FLP重組酶的識別位點 FRT序列，阿泊拉抗性(AprR);pGH112，大腸桿菌－鏈霉菌穿梭質粒載體，帶有氨芐抗性(AmpR)和硫鏈絲菌肽抗性(tsrR);pELA，lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重組質粒，帶有氨芐(AmpR)、硫鏈絲菌肽(tsrR)和阿泊拉抗性(AprR)。

1.2 培養基

E.coli ET12567/pUZ8002，E.coli BW25113 以及E.coliDH5α所用為LB培養基［6］;棒狀鏈霉菌所用產孢培養基為YMGA培養基［7］，種子培養采用TSB培養基，發酵培養采用SS培養基［8］。大腸桿菌－鏈霉菌接合培養基采用AS-1培養基(g/L)［9］。

培養基中抗生素的使用濃度如下:氨芐青霉素終濃度為 100 μg/mL，阿泊拉霉素為 25 μg/mL，卡那霉素為 50 μg/mL，氯霉素為 25 μg/mL，萘啶酮酸為 25 μg/mL。

1.3 常規分子操作

棒狀鏈霉菌總DNA的提取、質粒向鏈霉菌的接合轉移、鏈霉菌原生質體的制備及轉化均按Kieser等人［8］的方法進行，大腸桿菌質粒DNA的提取、限制性內切酶消化、連接、PCR以及轉化等操作均按Sambrook 等人［10］的方法進行。

1.4 引物設計及PCR

1.4.1 lat基因的 PCR 擴增

參照棒狀鏈霉菌編碼賴氨酸ε－轉氨酶的lat基因相應的核苷酸序列，設計合成如下引物:

引物 1:5’-GAATTC CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCA-3’

引物 2:5’-GGATCC AGCGCGTCCTTCACAGCGGTGTACTCCCGCCCGTCGACG-3’

其中引物1和引物2中劃線部分分別為EcoR I和BamH I酶切位點，以棒狀鏈霉菌的基因組DNA為模板，引物1和引物2進行PCR擴增，退火溫度n=61℃。

1.4.2 安普抗性框的PCR擴增

根據棒狀鏈霉菌中lat基因的序列及質粒pIJ773中安普抗性基因的序列(該序列中還包含轉移復制起始點oriT以及FLP重組酶的識別位點FRT序列，oriT便于后面重組質粒的接合轉移)設計一對長59nt及58nt的引物(引物3和引物4)，其中引物3包含20nt的安普抗性基因上游的FRT序列以及lat基因上游的一段39nt的互補序列，引物4包含19nt的安普抗性基因下游的FRT序列以及lat基因下游的一段39nt的互補序列(圖1.a)，兩引物序列如下:

引物 3:5’-CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCACCCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-

3’;引物 4:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCGACCGCTCGTCACAGTGCGGCCAGCGGCTCTCGCAGACT-3’。

按此引物PCR所得產物中應包含一個安普抗性基因，并且在它的兩端含有各帶有39bp的lat基因上下游的同源序列，將此PCR產物稱為安普抗性框。

以含有安普抗性基因的質粒pIJ773作為模板，引物3和引物4進行PCR擴增，退火溫度n=50℃，進行安普抗性框的擴增。

1.5 PCR-targeting構建重組質粒

1.5.1 重組質粒pGH112-lat的構建

將PCR獲得的lat基因片段經純化及EcoR I和BamH I雙酶切，與經同樣雙酶切的大腸桿菌－鏈霉菌穿梭質粒載體pGH112連接，所得的連接產物用于轉化 E.coli DH5α感受態細胞，得到重組質粒pGH112-lat(圖1.b)。

1.5.2 重組質粒pELA的構建

將驗證正確的重組質粒pGH112–lat電轉至Ecoli BW25113/pIJ790感受態中，獲得 E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat轉化子，將其制作成感受態細胞，將1.4.2中得到的帶有lat基因同源序列的PCR產物安普抗性框電轉化至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat感受態細胞中，將電轉后菌株的培養溫度由30℃提高到37℃，并在培養基中添加L-阿拉伯糖(終濃度為 10 mmol/L)。在 E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat的培養基中添加L-阿拉伯糖可誘導pIJ790中λRED的表達，在λRED功能啟動子的作用下，安普抗性框迅速地與重組質粒pGH112-lat發生同源重組，即安普抗性框兩端的lat同源序列與pGH112-lat所攜帶的lat基因發生同源雙交換，從而使lat基因中插入了含有aac(3)iv基因的安普抗性框，得到了一個lat基因被插入突變的重組質粒pELA(圖1.c)。由于pIJ790質粒中含有一個溫敏型的復制起始子和氯霉素抗性基因，當電轉后菌株的培養溫度由30℃提高到37℃并且不再向培養基中添加Cml抗生素后，pIJ790質粒的復制子不再轉錄并且在沒有抗生素的選擇壓力下，它便逐漸喪失了自我復制的能力。所以重組子中僅含有一種帶有lat突變基因的重組質粒。

1.5.3 lat基因內部被敲除的重組質粒pSCAR的構建

將含有安普抗性框的重組質粒pELA(抗性框的兩端含有FRT序列，該序列為FLP重組酶的識別位點)電轉至 E.coliDH5α/BT340中，BT340為溫敏型質粒，因此E.coliDH5α/BT340的感受態細胞的制備及培養過程溫度均控制在較低的30℃。

在42℃高溫誘導下質粒BT340可以表達FLP重組酶，FLP重組酶可以識別質粒pELA中安普抗性框兩側的FRT序列，將FRT之間的抗性基因敲除，在此過程中質粒BT340消失，之后原lat基因插入抗性基因的部分僅剩下81bp的scar序列(FRT序列經FLP酶切除后剩余的部分序列)，所得為lat基因內部被敲除的重組質粒pSCAR(圖1.g)。

1.6 棒狀鏈霉菌lat基因的突變

重組質粒pELA向棒狀鏈霉菌的轉移采用接合轉移的方法［8］，即以 E.coli ET12567/pUZ8002/pELA 為供體菌株，將重組質粒轉移至棒狀鏈霉菌中。篩選安普霉素抗性菌株，28℃培養3～5 d，直至孢子出現，收集孢子，將孢子在不含抗生素的YMGA培養基上進行松弛培養，并在該培養基上傳代3次，仍具有抗性的菌株初步確定為發生了雙交換的菌株(圖1.d，e)。

重組質粒pSCAR向棒狀鏈霉菌的轉移采用原生質體轉化的方法［8］，以25%的PEG1000介導，再生培養基采用R2YE培養基，由于重組質粒pELA安普抗性框中的具有接合轉移功能的oriT基因也同時被敲除，所以得到的重組質粒pSCAR為不具有接合轉移功能的質粒(圖1.g)，須通過原生質體轉化的方法轉入棒狀鏈霉菌中。

轉化子于30℃培養36h長出微小菌落后，用含8μg/mL硫鏈絲菌素(安普抗性框被敲除后采用重組質粒pSCAR所攜帶的硫鏈絲菌素抗性基因tsr進行篩選)的營養瓊脂覆蓋各轉化平板，繼續于30℃培養3 d。用無菌牙簽挑取轉化子于不含抗生素的YMGA平板，30℃培養3～4 d后，將長出的菌落分別于含有硫鏈絲菌素(Thio8)的營養瓊脂平板及含有安普霉素(Apr25)的營養瓊脂平板上影印妥當，對2種抗生素都敏感的菌落可初步斷定為lat基因中抗性基因被敲除的突變菌株(圖1.e～i)，PCR-Targeting構建棒狀鏈霉菌突變株的流程見圖1。

圖1 PCR-Targeting突變lat基因的流程圖Fig.1 Strategy of PCR-Targeting for lat mutation

1.7 發酵液中克拉維酸的HPLC分析

發酵液于10 000 r/min離心10 min，所得上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，按1∶5的比例與咪唑溶液混勻，30℃反應12 min后冷卻到20℃，生成的衍生物采用Shim-pack VP-ODS(150×4.6)C18色譜柱進行HPLC 分析［11］。

2 結果

2.1 重組質粒的構建

將PCR獲得的lat基因片段用EcoR I和BamH I雙酶切，與經同樣雙酶切的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒載體 pGH112連接，轉化 E.coli DH5α感受態細胞，得到重組質粒pGH112-lat。

將pGH112-lat及PCR獲得的安普抗性框電轉化至E.coli BW25113/pIJ790中，在 pIJ790中 λRED 的功能啟動子的作用下，安普抗性框迅速地與重組質粒pGH112-lat發生同源重組，從而使lat基因中插入了安普抗性框，得到了一個lat基因被插入突變的重組質粒。以該重組質粒為模板，以引物3、引物4進行PCR驗證，結果見圖2。

圖2 重組質粒pELA的PCR驗證Fig.2 PCR verification of recombinant plasmid pELA

由圖2可以看出，PCR產物大小在1.45kb處(圖中箭頭所指)，與安普抗性框大小相符。表明安普抗性框已成功整合到pGH112-lat的lat基因中，將該重組質粒命名為pELA。

將pELA電轉至 E.coliDH5α/BT340中，BT340為溫敏型質粒，在42℃高溫誘導下質粒BT340可以表達FLP重組酶，FLP重組酶可以識別質粒pELA中安普抗性框兩側的FRT序列(圖1.a)，將FRT之間的抗性基因敲除，原lat基因插入抗性基因的部分僅剩下81bp的scar序列(FRT序列經FLP酶切除后剩余的部分序列)，所得為lat基因內部被敲除的重組質粒 pSCAR(圖 1.g)，其理論大小應為 6.98kb。對所得轉化子進行提質粒及酶切驗證，結果見圖3，由圖可知電泳結果與其理論值大小相吻合，所得lat基因內部被敲除的重組質粒命名為pSCAR。

2.2 棒狀鏈霉菌基因突變株的驗證

分別以棒狀鏈霉菌出發菌株、lat基因中插入安普抗性框的突變株及抗性標記被敲除的突變株的基因組DNA作為模板，以lat基因上下游引物(引物1，引物2)進行PCR驗證，結果見圖4。由圖4可知以抗性標記被敲除的突變株基因組為模板的PCR產物大小在400bp－500bp之間，與理論值481bp相一致(安普抗性框兩側的39bp距lat基因的上下游分別為230bp和170bp，以及81bp的scar序列)，而對照菌株基因組的PCR產物為1.8kb，以lat基因雙交換突變株的基因組DNA作為模板的PCR產物為1.85kb(lat基因中的191～1 600bp被1.45kb的安普抗性基因所取代，因此PCR產物理論大小應為1.85kb)，證明lat基因中的抗性基因已經被敲除，所得的抗性標記被敲除的lat基因突變菌株，命名為S.clavuligerus lat::scar。

圖3 重組質粒pSCAR的酶切驗證Fig.3 Verification of recombinant plasmid pSCAR

圖4 突變株的PCR驗證Fig.4 PCR verification of the mutants

2.3 突變菌株克拉維酸產量的測定

對突變菌株lat::scar及出發菌株進行發酵培養，采用HPLC法對發酵120 h的發酵液進行克拉維酸含量的測定，結果見表1。

由表1可知，對同樣的發酵液測定其克拉維酸的產量，結果突變菌株的克拉維酸產量最高可達166 mg/L，是出發菌株的2.83倍，表明采用PCR-Targeting的方法對lat基因進行敲除有效提高了棒狀鏈霉菌的克拉維酸產量。

表1 突變菌株及原始菌株發酵液中克拉維酸產量的HPLC測定結果Table 1 HPLC analysis of clavulanic acid production of lat mutants and the original strain

3 結果討論

本實驗從影響棒狀鏈霉菌克拉維酸代謝的頭霉素C的早期合成基因lat入手，采用PCR-Targeting構建了棒狀鏈霉菌的lat基因被敲除的無抗性標記的突變菌株 S.clavuligerus lat::scar。

采PCR-Targeting構建的重組質粒由于具有接合轉移功能，易于轉入棒狀鏈霉菌中，并且由于插入到突變的目標基因中的選擇標記抗性框兩端帶有FRT序列，可通過FLP重組酶的識別作用方便的將最終所得的棒狀鏈霉菌工程菌株中的抗性基因敲除，得到無抗性的lat基因敲除的突變菌株，所得的不同突變株的克拉維酸產量是原始出發菌株的1.82～2.83倍。由于最終所得突變株無抗性標記，因此可以重復的將該方法應用于突變棒狀鏈霉菌的其他基因，實現用一種抗性標記突變同一菌株不同基因的目的，從而使突變同一菌株的多條基因時需要多種選擇性標記的問題得以解決，為鏈霉菌的基因工程方法改造提供了又一種可行的方法。

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