高濃度發酵中酵母菌性能調控及優化*

張琦，李文，林燕，馬海元，王欣澤，孔海南

1(上海交通大學環境科學與工程學院，上海，200240)2(長安大學環境科學與工程學院，陜西 西安，710064)

在合理控制情況下，高濃度乙醇發酵(濃醪發酵)能夠有效提高設備利用率、減少單位產物所消耗的能源，并降低雜菌污染的風險，是提高乙醇發酵生產效率、降低成本的有效工藝手段。然而，高濃度基質和產物對酵母菌的抑制作用導致菌體發酵性能低下，進而限制最終目標產物濃度［1］，仍是制約其工業化推廣的重要因素。

本文分別分析在酵母菌乙醇發酵過程中基質和產物對酵母菌性能的影響，系統研究酵母菌在不同抑制物濃度下的生長和發酵性能的變化規律，并且比較了實際發酵過程中酵母自身所產的內源乙醇與實驗中外源添加的乙醇對酵母菌發酵性能影響的差異，確定抑制物的作用閾值以及高濃發酵過程中的主要限制因子，為尋找減小抑制物對于酵母菌性能影響的有效措施，進一步提高木質纖維素乙醇生產效率和產物濃度提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742(－60℃保存，上海交通大學環境科學與工程學院生物實驗室提供)。

1.1.2 生長培養基

YPD 培養基［2］，pH 4.0 ～5.0。

1.1.3 發酵培養基［3－4］

NH4Cl 3.0 g/L;KH2PO40.7 g/L;MgSO4·7H2O 0.35 g/L;CaCl20.1 g/L;NaCl 0.1 g/L;MnSO4·4H2O 0.11 g/L;CuSO4·5H2O 1.0 mg/L;ZnSO4·7H2O 21.0 mg/L;CoSO4·7H2O 4.0 mg/L;H3BO340.0 mg/L;Na2MoO4·2H2O 0.2 mg/L;FeSO414.4 mg/L。

1.1.4 發酵基質

木質纖維素的水解液中，葡萄糖占還原糖絕對比例可達70%［5］，需著重研究以提高酵母菌對葡萄糖的轉化率，故本研究采用葡萄糖作為發酵基質。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養

復蘇后的酵母菌置于YPD液體培養基擴培，于全溫振蕩培養箱內進行，轉速180 r/min，溫度37℃，培養16～18 h。

1.2.2 間歇發酵

按既定濃度的酵母菌、營養液、基質和產物配制發酵反應液，而后將其置于集成控制自動化厭氧發酵罐內進行發酵，設置參數為pH 4.0，35℃，200 r/min，菌體濃度2 g/L。每批次實驗均平行啟用3個發酵罐同時同參數反應以控制誤差。

1.3 樣品分析方法

菌體濃度采用分光光度法檢測［6－7］，檢測波長選用600 nm;基質(葡萄糖)和產物(乙醇)檢測條件:島津液相色譜儀，色譜柱BIO-RAD 910－5250，柱溫65℃，RID－10A檢測器，溫度60℃，流動相超純水，流速:0.8 mL/min，進樣量 20 μL。

2 實驗分析與討論

2.1 高濃度基質對乙醇發酵的抑制

高濃發酵能夠提高設備利用率，減少熱能消耗和用水量，有效降低生產成本。但過高基質濃度所致的高滲環境，會減弱酵母菌細胞膜流動性及胞內關鍵代謝酶活性［9－10］，從而降低酵母菌乙醇發酵性能。當基質濃度高于閾值后，繼續提高基質濃度，產物將增長緩慢甚至停滯，造成原材料浪費。通過基質對酵母菌活性抑制作用的研究，能確定合理的基質投加量，在保證基質利用率及乙醇產率的前提下獲取最高的經濟效益。

實驗中，設置的基質濃度分別為:40、80、120、160、200、280 g/L。每批次發酵時間 96 h，每隔 24 h取樣。

2.1.1 基質對酵母菌生長的影響

圖1為不同基質濃度下酵母菌濃度變化的對比圖。當基質濃度低于160g/L時，菌體濃度隨著基質濃度的提高而顯著增加。這是因為葡萄糖是酵母細胞最重要的碳源，亦是重要的初期信號分子，酵母菌會根據外界基質變化來調節自身各種酶的表達水平及活性，達到最佳的代謝生長水平，最終達到最適種群密度［9］。所以在基質濃度較小時，不斷提高的基質濃度改善了酵母菌的營養條件，酵母菌濃度隨之增長。

圖1 不同基質濃度下酵母菌濃度隨時間變化Fig.1 Variation of yeast concentration under different substrate concentration

當基質濃度大于160 g/L時，在反應初期，酵母菌對高滲環境作出應激反應，迅速提高種群密度以加快基質的總消耗速率，改善高滲環境，因而在前24小時有著較高的增長速率。但由于高濃度基質對酵母菌細胞膜流動性及胞內關鍵代謝酶的抑制作用，后期菌體增長速率明顯放緩。比較發酵96 h內酵母菌的最大濃度，繼續提升基質濃度，菌體濃度反而略有減小，可見高濃度基質對酵母菌生長繁殖存在一定的抑制作用。

圖2為基質濃度與平均對基質菌體得率擬合圖，隨著基質濃度的逐漸升高，平均對基質菌體得率顯著減小，即消耗單位的葡萄糖所生成的細胞數量逐漸下降，更多的葡萄糖消耗用以維持細胞能量，印證了高基質濃度對菌體生長繁殖的抑制作用。初始基質濃度S0和平均對基質菌體得率YX/S呈對數關系［11］，具體如下式。

圖2 基質濃度與平均對基質菌體得率擬合圖Fig.2 Fitting of substrate concentration and average yeast yield to substrate

2.1.2 基質濃度對酵母菌乙醇發酵性能的影響

圖3是不同基質濃度下發酵所得最大乙醇濃度變化曲線，基質濃度小于160 g/L時，產物濃度隨基質增加顯著提高;但當濃度大于160 g/L后，繼續增加基質，最終乙醇濃度未見明顯增長，一直穩定在53 g/L左右。因此，高于160 g/L的基質濃度對于乙醇發酵無實際意義，僅造成原材料的浪費。

圖3 不同基質濃度下最大乙醇濃度變化Fig.3 Maximum ethanol concentrations under different substrate concentration

圖4是不同基質濃度下乙醇產率隨時間變化關系圖。隨基質濃度增加，發酵所需時間相應增加:80 g/L至200 g/L時，反應需72 h，而280 g/L時，發酵96 h仍未完成。實驗結果表明除了發酵負荷增加外，高濃度基質對酵母菌發酵活性的抑制亦是導致酵母菌性能下降及發酵反應時間延長的主要原因。

圖4 不同基質濃度下乙醇產率變化Fig.4 Comparison of ethanol yields under different substrate concentration

就乙醇產率(實際乙醇產量與理論乙醇最大產量之比)而言，基質濃度為80 g/L時在48h能達到84%乙醇產率，而在72 h時，產率進一步提升至94%，乙醇最終濃度可達40 g/L，達到了營養條件與滲透壓的平衡，是最佳的發酵基質濃度。但在實際工業生產過程中，并非追求最高的乙醇產率，而是單位時間內單位生產設備所產生的乙醇總量。因而即使最終產率略低，只要同生產一周期內最終獲得更高的乙醇濃度，又不至于造成基質的大量浪費，才是符合生產工藝要求的基質濃度。如當基質濃度為120 g/L時候，雖然由于高濃度基質對酵母性能抑制而導致菌體對基質得率和最終乙醇產率的下降，但仍能達近80%的乙醇產率，所得乙醇濃度為48 g/L，為工藝可接受范圍。

基質濃度為160 g/L時，所得乙醇濃度為53 g/L，產率降至65%，酵母菌活性受到較大程度的抑制，但基質的投加仍能提升最終產物濃度。而當基質濃度大于160 g/L后，繼續增加基質投加量，乙醇產率和發酵速率急劇下降，相應地，產物最高濃度幾乎不再增加，甚至略有減小，浪費大量原材料和時間?；|濃度為280 g/L時，產率僅為40%，最終產物濃度為55 g/L，酵母菌的發酵性能受到了嚴重抑制。

因此，在實驗條件下160 g/L為基質的最大投加濃度，高于該值時，酵母生長和發酵性能急劇下降，繼續增大基質濃度對發酵已無實際意義。對于實驗酵母菌株的性能改進和發酵工藝的優化是提高工業生產過程中投加最高基質濃度及生產效益的有效措施。

2.2 產物對乙醇發酵的影響

乙醇是釀酒酵母厭氧發酵的重要產物，但對酵母細胞本身又是毒素和抑制劑［12］。在高濃發酵過程后期，存在著基質和產物的協同抑制作用。因而在研究產物乙醇的單獨抑制作用時，需模擬出低基質濃度高產物濃度的發酵狀態，即在低基質濃度的初始反應條件下，額外加入不同濃度乙醇，從而得出產物對厭氧乙醇發酵過程中酵母菌性能的單獨抑制作用。

實驗中，設置的初始添加乙醇濃度梯度為0、10、20、30、40、50、60、70、80 g/L，基質濃度均選為 80 g/L，發酵96 h，每隔24 h取樣。

2.2.1 產物對酵母菌生長抑制

圖5是不同初始乙醇濃度下酵母菌生長情況對比。

圖5 不同初始乙醇濃度下菌體濃度隨時間變化Fig.5 Variation of yeast concentration under different initial ethanol concentration

初始添加的乙醇對于酵母菌的增長具有抑制作用，在低濃度乙醇(小于30 g/L)情況下，菌體量的增幅雖隨著乙醇濃度提高緩慢減小，但最高菌體濃度對比初始濃度仍有70%以上的增長，且菌體濃度在24 h已達最大值，外源乙醇對于酵母菌增長的抑制作用不明顯;而在較高乙醇濃度(30～50 g/L)下，酵母菌的濃度最高只增長了30%左右，酵母菌的生長開始受到了較嚴重的抑制，同時酵母菌的延滯適應期也明顯增加，對于初始添加40 g/L乙醇時，酵母菌在24 h基本未增長，在48 h達最大濃度，而初始添加50 g/L乙醇時，前48 h菌體均處于停滯期，72 h才達最大濃度;繼續增高乙醇濃度，酵母菌在整個實驗時間段內均增長非常緩慢，菌體濃度增長率均小于10%，當乙醇濃度大于70 g/L后，菌體濃度完全停止增加，甚至略有減小，酵母菌的生長繁殖由于受到了高濃度產物的強烈抑制作用已完全停止。

2.2.2 產物對酵母菌乙醇發酵性能的抑制

雖然乙醇在低濃度時對于酵母菌的生長無明顯抑制作用，但對于酵母菌葡萄糖代謝活性卻有著顯著抑制作用。由圖6不同初始濃度下葡萄糖轉化率比較可得，就最終的葡萄糖的轉化率而言，隨著乙醇添加量的增加而迅速減小:在空白對照實驗中，酵母菌96 h能夠消耗所有的葡萄糖，乙醇濃度10 g/L時，轉化率為60%;而在20 g/L時，葡萄糖轉化率進一步下降到只有30%;乙醇濃度大于70 g/L后，葡萄糖幾乎不再消耗，酵母菌對葡萄糖的代謝受到嚴重抑制。

圖6 不同初始乙醇濃度下葡萄糖轉化率比較Fig.6 Comparison of glucose consumption rate under different initial ethanol concentration

通過對比圖6和圖7可以得出，葡萄糖轉化率和乙醇產率變化規律非常一致，酵母菌消耗的葡萄糖幾乎均有效轉化為乙醇。由此可推斷，在乙醇發酵過程中，葡萄糖的轉運和代謝是主要限制性因素，是整個發酵過程中限速步驟［13－14］，最終乙醇產率低下主要原因是受到上游代謝途徑中葡萄糖轉化率低下所制約。因而提高糖酵解途徑及糖轉運系統中關鍵酶在高乙醇濃度下的活性是加強酵母菌乙醇發酵性能的重要措施。

圖7 不同初始濃度乙醇下乙醇產率變化Fig.7 Comparison of ethanol yield under different initial ethanol concentration

鑒于圖5中所示不同乙醇濃度下酵母菌濃度存在較大差異，為了排除菌體濃度對乙醇發酵性能的影響，故采用單位質量酵母菌單位時間所產乙醇質量即乙醇發酵速率［15］來表征在不同乙醇濃度下的酵母菌實際發酵性能。

圖8是不同的初始乙醇濃度下乙醇發酵速率的變化曲線。

圖8 不同初始濃度乙醇下乙醇發酵速率變化Fig.8 Comparison of ethanol fermentation rate under different initial ethanol concentration

由圖8可得:(1)隨著初始乙醇濃度的提高，各時段乙醇發酵速率總體呈下降趨勢。對于各反應時間段，0～24 h發酵速率差異最大，而反應后期，由于本身乙醇發酵速率均較小，因而在不同初始乙醇濃度下發酵速率差異性較小，圖中24～48 h、48～72 h、72～96 h 3條曲線較0～24 h明顯平緩。(2)不同初始乙醇濃度下發酵速率變化也存在明顯區別。在較低初始乙醇濃度(小于30 g/L)情況下，前24 h的乙醇發酵速率顯著高于后期的乙醇發酵速率，發酵后期，由于酵母菌自身產生的內源乙醇疊加抑制作用，加之底物和營養物質消耗，酵母菌所處系統環境更為惡劣;相反地，對于高濃度初始乙醇的發酵環境，整個過程中乙醇發酵速率無顯著變化，甚至部分后期發酵速率高于前期，這是由于系統本身的乙醇增量不明顯，并且底物和營養物質的消耗均很少，環境變化不大，因而逐漸適應高濃度乙醇環境的酵母菌發酵性能可保持穩定，甚至在后期略有提升。

在模擬的高產物低基質濃度發酵環境中，乙醇對酵母菌生長和發酵性能具有嚴重抑制作用，是影響最終木質纖維素乙醇生產效益的重要因素。究其原因，除了嚴重抑制酵母細胞糖代謝和轉運途徑外［14］，乙醇還抑制細胞膜上ATP酶活性導致質子濃度梯度的破壞，造成胞內營養元素的流失，同時又改變細胞膜上的磷脂組分和麥角固醇含量，增加細胞膜非特異透過性，削弱其對酵母細胞的保護作用;另外乙醇還引起胞內線粒體氧化損傷，進一步降低了酵母菌的乙醇發酵性能［16－17］。正是由于乙醇對酵母細胞多方面的毒害作用，酵母菌對乙醇非常敏感，為保持酵母菌較高生長和發酵活性，需保證發酵液中乙醇濃度小于30 g/L。當產物濃度大于酵母菌對外源乙醇的最大耐受濃度70 g/L后，菌體生長和發酵完全停止。設法降低產物的抑制作用是提升乙醇產率最為直接和有效的途徑。

2.2.3 內外源乙醇抑制對比

2.2.1 和2.2.2的實驗結果證明了產物乙醇對于酵母菌厭氧乙醇發酵的強烈抑制作用，但模擬實驗和實際發酵結果還存在一定區別:如在基質抑制實驗中得到酵母乙醇發酵的實際過程中，最大產物濃度僅55 g/L，此結果低于外源乙醇抑制實驗中所得到的最大耐受濃度70 g/L。出現此現象的原因除了發酵初期高濃度基質對酵母菌乙醇發酵性能的協同抑制作用外，外源添加的乙醇與酵母菌自身發酵所產生的內源乙醇對于酵母菌的抑制作用的差異也有可能是重要原因，因此有必要系統對比相同濃度下內源和外源乙醇對于酵母發酵的抑制作用。

設置的外源乙醇濃度為 10、20、30、40、50、60、70、80 g/L，只測定不同外源乙醇濃度下0 h，12 h的酵母菌濃度、葡萄糖濃度和乙醇濃度，以排除后期酵母菌發酵產生的內源乙醇抑制作用的干擾;內源乙醇抑制對比實驗取樣時間為每隔12 h，共96 h，初始不添加乙醇，其余實驗及檢測條件保持完全一致不采用。

內外源乙醇濃度酵母菌比增長速率的對比情況同見圖9。當乙醇濃度小于15 g/L時，內外源乙醇對于酵母菌的生長抑制作用沒有明顯區別;乙醇濃度大于15 g/L時，與外源乙醇環境相比較，在內源乙醇環境中的酵母菌比增長速率減小幅度明顯加劇。在28 g/L內源乙醇下，菌體比增長速率已降為零，而對于外源乙醇，酵母菌耐受濃度達70 g/L，高濃度情況下內源乙醇對于酵母菌生長的抑制作用顯著大于外源乙醇。

圖9 內外源乙醇下12h酵母菌平均比增長速率對比圖Fig.9 Comparison of 12 h-averaged specific yeast growth rate under endogenous and exogenous ethanol

圖9內外源乙醇作用下乙醇發酵速率的對比曲線見圖10。在相同濃度下，內源乙醇作用下酵母菌乙醇發酵速率均低于外源乙醇作用下的發酵速率，即酵母菌對內源乙醇更為敏感，如當乙醇濃度為38 g/L時，內源乙醇下發酵速率已經很低，僅為0.005 g乙醇/(g酵母菌·h)，而外源乙醇下發酵速率仍大于0.200 g乙醇/(g酵母菌·h)。由圖10可得，就乙醇發酵速率隨乙醇濃度的衰減規律，外源乙醇下呈線性衰減，而內源乙醇時則為高次冪衰減［18］。

圖10 內外源乙醇下12 h乙醇平均發酵速率對比圖Fig.10 Comparison of 12 h-averaged ethanol fermentation rate under endogenous and exogenous ethanol

在對比實驗中，所選基質濃度為80 g/L，而綜合先前的實驗結果，當反應的基質濃度更高時，由于酵母菌對高濃發酵環境的逐漸適應，其乙醇耐受濃度有所增加，所以酵母菌發酵對內源乙醇最大耐受濃度為2.1所述實際發酵中所獲得的最高產物濃度55 g/L。

綜上所述，無論對酵母菌的增長抑或發酵性能，內源乙醇的抑制作用均大于外源乙醇的抑制作用。分析原因，主要由于發酵過程中乙醇向細胞外散速率有限，導致酵母細胞內乙醇濃度高于胞外［19］，而細胞內部高濃度乙醇的長時間積累以及向胞外的持續滲透不斷抑制著酵母細胞的生理活性，其影響程度大于高濃度外源乙醇對酵母菌的沖擊。另外，由于細胞膜的保護作用，減緩降低了外源乙醇向細胞內的滲透和毒害作用，減小及延緩了乙醇對細胞內酶活及胞內器官的損害。所以，若在產物乙醇累計至高濃度后才提取，可能對于恢復酵母活性以提高最終乙醇發酵效率作用不大，因為胞內高濃度乙醇的積累及向外滲透過程已經造成了酵母細胞不可逆破壞;而若通過循壞氣提、真空提取法等發酵提取耦合技術，始終將乙醇維持在較低濃度，雖可以有效減小產物對酵母菌的抑制作用［20－21］，卻對工藝提出更高要求，亦進一步增加生產成本，需要對兩者作出權衡。

在實際發酵過程中的高濃度內源乙醇環境下，酵母菌的生長和發酵均受到了更嚴重的抑制，酵母菌的最大耐受濃度小于70 g/L，所以在高產物濃度下，提高酵母菌的生長及發酵活性對于保證最終的高乙醇產量和生產效益顯得更為重要。

2.3 高濃發酵中酵母菌性能關鍵指標

通過以上實驗，定量表述了高濃發酵中酵母菌Saccharomyces cerevisiae BY4742在不同基質和產物濃度下生長及發酵活性的變化情況，并得出了實驗酵母菌的性能關鍵指標，即其對基質和產物的耐受濃度。詳見表1。

表1 Saccharomyces cerevisiae BY4742發酵關鍵濃度指標Table 1 Key concentrations index for Saccharomyces cerevisiae BY4742

3 總結與展望

本文以燃料乙醇生產環節中重要的發酵步驟為研究對象，探索了基質和產物對厭氧乙醇發酵過程中酵母生長及發酵性能的抑制作用，確定了基質對酵母菌性能抑制的臨界濃度值以及酵母菌所能耐受的最大產物濃度，同時比較了內源和外源乙醇對酵母菌抑制程度的差異，所得結論如下:

(1)酵母菌乙醇發酵的最佳基質濃度為80 g/L，乙醇產率可達94%。繼續提高基質濃度，雖然乙醇產率有所下降，但仍能達到80%，且發酵所產乙醇濃度也不斷增加，可至55 g/L;當基質濃度大于臨界值160 g/L后，由于受到高濃度基質的顯著抑制作用，產率降至65%以下，且最終發酵所得乙醇濃度和最終菌體濃度都幾乎不再增加，甚至略有減小，基質濃度繼續提高對于乙醇發酵已無實際意義。

(2)產物乙醇對于酵母菌的生長和發酵性能具有顯著抑制作用，是高濃發酵過程中制約乙醇產量的重要因素。

(3)內源乙醇對酵母菌生長及乙醇發酵性能的抑制作用均大于外源乙醇。單就乙醇發酵而言，酵母菌對于外源乙醇的最大耐受濃度為70 g/L，對內源乙醇該濃度則為55 g/L。所以，設法保證酵母菌在高濃度產物下的活性是提高乙醇總產量進而推廣木質纖維素制乙醇工業化生產的最為直接和關鍵措施。

對于減弱乙醇的抑制作用、提高酵母活性，還可從以下幾方面進行:

(1)篩選、馴化或通過基因工程改造酵母菌，取得高乙醇耐受性酵母菌株，保證其仍能在高濃度乙醇環境中保持較高活性，以減小乙醇抑制作用。

(2)反應進程中及時添加酵母所需微量元素及其他營養物質，以彌補反應中營養物質流失及消耗而導致的酵母活性降低的問題。

(3)反應至一定進程后，及時提取發酵液中乙醇，同時添加少量高活性新鮮酵母，以達到降低最終殘糖濃度、提高乙醇產率之目的。

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