旋光法研究L-半胱氨酸在食品加工條件下的穩定性*

葉麗君，黃雪松

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys;L-α-氨基-β-巰基丙酸)，比旋光度［α］20D=+6.5°(5 mol/L HCl中);L-Cys具有還原性基團巰基(—SH)，在中性或微堿性水溶液能被空氣氧化成L-胱氨酸(L-Cystine，L-Cys-Cys)，酸性溶液較為穩定［1］。L-Cys是蛋白質、酶等生物活性物質的組成成分之一，具有多種生理活性［2－3］。在食品、藥品中有抗氧化和防止非酶褐變作用，常用作抗氧化劑或營養強化劑。由于L-Cys在醫藥、食品、化妝品等行業中被廣泛地運用，了解L-Cys其加工、貯運中穩定性或變化規律，對于發揮L-Cys的作用和保證有關產品的質量則極為必要。

檢測L-Cys含量的方法主要有電分析化學法、高效液相色譜法、自動分析儀法、化學滴定法、旋光度法和紫外分光光度法等［4－5］。這些測定方法需要專門儀器，操作繁瑣，難以測定L-Cys在相關產品、尤其在食品加工條件下的變化過程。本研究根據多組分旋光物質體系的旋光度具有加和性這一特性，測定LCys在常溫下、有氧和無氧溶液、H2O2、NaHSO3存在下和不同溫度下的旋光度變化，探討L-Cys在加工過程中的變化規律，為加工過程中減少L-Cys的變化提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

WZZ-2B自動旋光儀，上海精密科學儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠。L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cys·HCl，食品級，含量 ＞98%)，廣東大地食用化工有限公司;L-胱氨酸(優級純)，上海索萊寶生物科技有限公司;HCl，Na2HPO4，檸檬酸，H2O2，Na2SO3均為分析純，廣州化學試劑廠。

Mcllvaine緩沖溶液的配制，見參考文獻［6］。

1.2 實驗方法

1.2.1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值溶液中比旋光度的測定

稱取5.00 g L-Cys·HCl于具塞試管中，分別加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。以相應的pH值緩沖溶液為空白調零，測定各個pH值下溶液的旋光度，并計算各自比旋光度和摩爾旋光度。

稱取2.00 g L-Cys-Cys，用1 mol/L HCl定容至100 mL。取5 mL L-Cys-Cys溶液中，分別加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。以相應的pH緩沖溶液為空白調零，測定各個pH值下溶液的旋光度，并計算各自比旋光度和摩爾旋光度。

1.2.2 測定L-Cys在不同pH值下的旋光度

稱取5.00 g L-Cys·HCl于具塞試管中，分別加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。在暴露于空氣的條件下，每隔1 h測定各個pH值下溶液的旋光度，確定L-Cys最穩定時所對應的pH值。

1.2.3 溶液中溶氧對L-Cys旋光度的影響

分別稱取5.00 g L-Cys·HCl于2支具塞試管中，各加入由1.2.2所確定的pH值且經過煮沸后冷卻和搖晃5 min以充分溶氧的Mcllvaine緩沖溶液，分別定容至25 mL。在隔絕空氣的條件下，每隔1 h，測定各自旋光度。

1.2.4 配制指定pH值的L-Cys溶液

稱取5.00 g L-Cys·HCl于具塞試管中，加入由1.2.2所確定的pH值的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。

1.2.5 H2O2對L-Cys旋光度的影響

在根據1.2.4所配制的的L-Cys溶液中加入0.1 mL 30%H2O2后、在隔絕空氣的條件下，立即測定其旋光度，然后每隔5 min測定其旋光度。

1.2.6 NaHSO3對L-Cys旋光度的影響

在根據1.2.4所配制的的 L-Cys溶液中加入0.10 g NaHSO3，在暴露于空氣的條件下，每隔1 h測定其旋光度。

1.2.7 溫度對L-Cys旋光度的影響

將1.2.4所配制的的L-Cys溶液分別于60℃和100℃的恒溫條件下，每隔15 min測定其旋光度。

1.3 旋光度、反應速率常數 k和半衰期 t1/2的計算［7］

根據旋光度的加和性，推導L-Cys和L-Cys-Cys兩者的旋光度與各自濃度的計算公式分別為:

式中c0，c1和 c2分別表示 L-Cys的初始濃度，LCys-Cys和L-Cys-Cys的最終濃度的濃度(mol/L)，M摩爾比旋光度(其為比旋光度［α］和摩爾質量Mr的乘積)。

以c對t作圖，所得函數曲線的斜率即為反應速率常數 k［mol/(dm3·h)］，即:

式中:c是L-Cys的濃度(mo/L);t是反應時間(h);a為所得函數曲線在縱坐標上的截距，為常數;t1/2為半衰期(h)。

2 結果與討論

2.1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度

L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度變化結果分別見圖1。由圖1可知，L-Cys和L-Cys-Cys的比旋光度均隨著pH值升高而降低，且其變化規律分別符合一次函數:［α］=－0.434(pH)－6.69(R2=0.985)和［α］= －11.73(pH)－192.6(R2=0.942)。t檢驗(P=0.01，n=6)表明，這2個方程可反映 L-Cys和 L-Cys-Cys隨 pH值變化的規律［8］。因為L-Cys和L-Cys-Cys是具有酸堿兩性的氨基酸，pH值不同，其電離度、分子構象不同，而分子構象決定旋光性物質的旋光度［9－10］，所以pH影響其比旋光度的大小。因此，在研究L-Cys和L-Cys-Cys時，不應忽略它們隨pH值而變化的影響。

圖1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度變化規律Fig.1 Specific rotation changes of L-Cys in different pH values

2.2 室溫下L-Cys在不同pH值下的氧化破壞

由圖2可見，pH 3.0～8.0時，隨著時間的增加，L-Cys的濃度降低;L-Cys的氧化符合零級反應，即其反應速率與反應物的濃度無關［7］。根據式1和式2式計算L-Cys在pH 3.0～8.0緩沖溶液中的氧化動力學參數見表1。L-Cys的氧化屬于非酶化學反應，應當符合質量作用定律。以L-Cys濃度c對時間t作圖，得直線(如圖2)。

圖2 pH 3.0～8.0時L-Cys的氧化曲線Fig.2 Oxidation curves of L-Cys at pH 3.0～8.0

由表1可知，L-Cys在不同pH值下的氧化符合零級反應。其中在pH 3.0時，L-Cys的氧化反應速率常數最小，為 2×10－7mol/(dm3·h)，半衰期最長，為2.76×106h;在pH 4.0和pH 8.0時，L-Cys的氧化反應速率常數均達到最大，為9×10－7mol/(dm3·h)，是L-Cys在pH 3.0的緩沖溶液中的氧化反應速率常數的4.5倍，而半衰期分別為6.13×105h和6.23×105h。

表1 常溫下L-Cys在不同pH值的緩沖溶液中的氧化動力學參數Table 1 Kinetic parameters of oxidation of L-Cys in different pH values at room temperature

2.3 溶液中溶氧對L-Cys氧化破壞的影響

溶液(pH 3.0)是否溶氧對L-Cys氧化的影響如圖3所示。L-Cys在溶液中有氧和無氧時，其氧化破壞均符合零級反應。溶液中是否溶氧影響L-Cys濃度，但對L-Cys的氧化速率幾乎無影響，二者氧化速率常數均為2×10－7mol/(dm3·h)，這可能是由于在有氧溶液中，L-Cys一開始便迅速與其中的氧氣反應生成L-Cys-Cys，所以在溶液無氧時較有氧時的濃度高。同時有氧溶液中氧氣幾乎被耗盡，其體系近似于無氧溶液體系;而二者均是在隔絕外界氧氣的條件下測定的(見1.2.3)，所以L-Cys在有氧和無氧溶液中的氧化速率常數相等。此外根據1.2.2和圖2可知，即使L-Cys溶液在暴露于外界空氣時測定，其氧化速率常數仍為2×10－7mol/(dm3·h)，由此推測L-Cys的氧化可能與溶氧速率有關?？梢?，在實際生產中，在pH 3.0、常溫的體系中存在L-Cys，若避免加快溶氧速率的操作(如避免攪拌、隔氧等措施)，體系中的L-Cys可穩定存在。

圖3 溶液中有氧無氧時L-Cys氧化曲線(pH 3.0)Fig.3 Oxidation curves of L-Cys in aerobic and anaerobic solutions(pH 3.0)

2.4 H2O2對L-Cys的氧化破壞

圖4－(a)是pH 3.0、溶液中加入H2O2后L-Cys的氧化情況，即加入H2O2后，L-Cys溶液迅速被氧化成L-Cys-Cys;隨時間增加、H2O2被逐漸消耗完，LCys濃度降低的速率減小。根據圖4－(a)的曲線可見，在0～0.42 h時，體系中L-Cys的濃度變化接近一條直線。為便于比較，將0～0.42 h的L-Cys溶液氧化反應初期的數據按零級反應處理(見圖4－(b))，L-Cys的氧化反應速率常數從未添加H2O2時(見表1)的2 ×10－7mol/(dm3·h)增加至9 ×10－6mol/(dm3·h)，反應速率是未添加H2O2的45倍，半衰期由2.76×106h減少至6.10×104h。這主要是因為過氧化氫的氧化還原電位Eθ(H2O2/H2O)=+1.77 V，而 O2的氧化還原電位 Eθ(O2/H2O)= +0.816 V，前者比后者大得多［11－12］。所以在本試驗中，L-Cys溶液加入H2O2后是隔絕外界空氣進行測定的，但是其氧化反應速率常數仍比未添加H2O2、暴露于外界空氣時的大得多。

2.5 NaHSO3對L-Cys的氧化破壞

圖5是pH 3.0、溶液中存在NaHSO3時L-Cys的氧化破壞情況。由圖5和 圖2可見，當溶液中添加NaHSO3后，L-Cys的氧化反應速率常數是未添時的10倍，為2×10－6mol/(dm3·h)，其半衰期為2.76×105h?？梢奛aHSO3對L-Cys氧化成L-Cys-Cys的反應具有促進作用。這主要是由于Eθ(L-Cys-Cys/LCys)=－0.34 V，而在酸性溶液中，HSO3－以H2SO3的形式存在，Eθ(H2SO3/HS2O4－)= －0.08 V，表明L-Cys的還原性大于 H2SO3。根據 Eθ(H2SO3/HS2)－ Eθ(L-Cys-Cys/L-Cys)=+0.26 V ＞ +0.2 V，體系中可能發生反應:2L-Cys+H2SO3→ L-Cys-Cys+HS2O4－+H2O+H+，從而促使L-Cys氧化成 L-Cys-Cys［11，12］。而在本試驗中，加有 NaHSO3的L-Cys溶液在是暴露于外界空氣下測定的，空氣中氧氣加上NaHSO3的雙重氧化作用，使L-Cys的氧化速率常數增加。NaHSO3和L-Cys在食品生產中都可用作抗氧化劑［13］，據上述結果與分析可見，NaHSO3會加速L-Cys的氧化，不能作為保護L-Cys的抗氧化劑使用。

圖4 H2O2存在時L-Cys氧化破壞曲線(pH 3.0)Fig.4 Oxidation curve of L-Cys in solution containing H2O2(pH 3.0)

圖5 NaHSO3存在時L-Cys氧化降解曲線(pH 3.0)Fig.5 Oxidation curve of L-Cys in solution containing NaHSO3(pH 3.0)

2.6 溫度對L-Cys的影響

根據旋光度的加和性可知，L-Cys被氧化生成LCys-Cys，其混合液總旋光度應減小。但由圖6可見，pH 3.0、在加熱條件下，L-Cys溶液的總旋光度不隨時間增加而逐漸減小，而是出現無規律的變化。這說明在加熱條件下，尤其是加熱至100℃ 時，L-Cys不僅發生氧化反應生成L-Cys-Cys，而可能發生其他化學反應形成不同的物質，因而導致其旋光度出現不規律變化。L-Cys具有熱不穩定性，其水溶液加熱至100℃以上會發生熱降解反應，根據溶液pH值不同生成不同物質，如160℃時，在pH 2.2時會主要生成噻吩硫醇、三噻環庚烯等，在pH 5.1和pH 7.1時則主要生成2-甲基三硫化合物［14－16］。在本實驗條件下，雖然加熱沒超過100℃，但通過L-Cys溶液旋光度變化可知，L-Cys在加熱至60℃時開始呈現不穩定性，不是只氧化生成L-Cys-Cys。當加熱至100℃時，溶液總旋光度變化幅度更大，更無規律，說明L-Cys可能發生了熱降解，生成了其他復雜的化合物而非單純的L-Cys-Cys，所生成的其他化合物又有各自的旋光度，導致體系的總旋光度不如預期般逐漸減小。

圖6 溫度對L-Cys旋光度的影響(pH 3.0)Fig.6 The influence of temperature to optical activity of L-Cys(pH 3.0)

3 結論

L-Cys和L-Cys-Cys的比旋光度和pH值的關系呈極顯著正相關，分別符合一次函數:［α］=－0.434(pH)－6.69(R2=0.985)和［α］= －1.73(pH)－192.6(R2=0.942)。在pH值3.0～8.0內，L-Cys的氧化反應符合零級反應，其氧化反應速率常數在pH 3.0時最小，在pH 4.0和pH 8.0時均達到最大。溶液中是否有氧會影響L-Cys的起始濃度，其濃度在無氧溶液中比在有氧溶液中高，但是不會影響其氧化速率常數。溶液中存在H2O2時使L-Cys的氧化速率常數增大，促進其氧化形成L-Cys-Cys。溶液中加入NaHSO3后，在空氣中氧和 NaHSO3的雙重氧化作用下，L-Cys溶液的氧化速率常數是未加NaHSO3的10倍，因此NaHSO3不能作為保護L-Cys的抗氧化劑。L-Cys具有熱不穩定性，當加熱至60℃時其溶液總旋光度開始出現無規律變化，其化學結構被破壞;當加熱至100℃時，其溶液總旋光度變化更不規則，L-Cys可能發生熱降解產生多種化合物。

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