嗜酸乳桿菌轉化菜籽油生成共軛亞油酸條件的優化*

李垚，徐爾尼，楊欣，胡冰彬

(南昌大學生命科學與食品工程學院食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌，330047)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是指一系列含有共軛雙鍵、具有不同位置和空間的十八碳二烯酸同分異構體的混合物，其中最具有生理活性的異構體是 c9，t11 － CLA 和 t10，c12 － CLA［1］，它們具有多種營養和保健功能，如抗癌、減肥、抗動脈粥樣硬化和延緩機體免疫力衰退等［2］。乳酸菌細胞膜上的亞油酸異酶具有將亞油酸轉化生成CLA的能力，由于易培養、生成的異構體單一、反應條件溫和、產量大、安全性高等優點，因此使用乳酸菌進行生物轉化合成CLA已成為當前研究熱點。

近幾年利用微生物靜息細胞轉化生成CLA為眾多研究者所關注，這是由于微生物細胞轉化技術操作簡單，在反應體系液中干擾物質少，不易染菌，更有利于下游的純化和檢測等優點，但尋找更為廉價的轉化底物是當前重要的研究方向。菜籽油來源廣泛，價格比亞油酸低廉，其中含有約20%的亞油酸，這些亞油酸在乳酸菌亞油酸異構酶作用下可轉化生成附價值極高的CLA。

本文研究了轉化液介質、介質濃度、pH、溫度、時間、細胞濃度、金屬離子等因素對嗜酸乳桿菌(Lactibacillus acidophilus)CGMCC 1.1854靜息細胞轉化菜籽油生成CLA的影響，并利用Box-Benhnken中心組合設計和響應面法對菜籽油轉化生成CLA的時間、pH、溫度、細胞濃度進行了工藝條件的優化分析，以期達到提高CLA產量的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

嗜酸乳桿菌(Lactibacillus acidophilus)CGMCC 1.1854，來自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

共軛亞油酸標準品 (含有c9，t11和t10，c12兩種異構體，純度≥99%)，Sigma公司;其他試劑均為國產分析純;菜籽油(酸價5.05，皂化值185)，來自江西婺源;亞油酸(純度≥98%)，上海試劑一廠;豬胰脂肪酶(酶活≥10 000U/g)，上海博奧生物科技公司。

1.1.3 主要儀器

紫外/可見分光光度計(751)，上海分析儀器廠;恒溫振蕩器(THZ-C)江蘇太倉市實驗設備廠;低速大容量離心機(DL-5-B)上海安亭科學儀器廠;酸度計(PHS-25型)等。

1.1.4 MRS培養基

酪蛋白胨10.0 g、牛肉提取物10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二胺2.0 g、吐溫 －80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO40.2 g、Mn-SO40.05 g、蒸餾水 1.0 L、pH 6.8，121 ℃ 滅菌 20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽油的乳化［3］及水解處理［4］

稱取1.26 g吐溫-80和0.75 g司盤-80，混勻，然后70℃水浴2 min，再加入1.5 g菜籽油，逐漸滴入去離子水，形成油包水型乳化液，至菜籽油終濃度為75 mg/mL。超聲乳化處理(300 W，超聲5 s，間歇3 s，重復8次)，形成穩定的乳濁液，121℃滅菌20 min，4℃保存備用。

1.2.2 乳酸菌細胞的收集

從新鮮斜面挑取1環活化菌種接到150 mL MRS培養基中，37℃下靜置培養20 h，即為種子液。按5%接種量接種至亞油酸含量為0.2 mg/mL MRS培養基中進行增殖誘導培養，37℃下靜置培養18 h。培養液冷凍離心(4 500×g，25 min，4℃)，去上清液，沉淀細胞用無菌生理鹽水洗滌1次，離心收集細胞，稀釋至菌體細胞濃度為0.25 g/mL。

1.2.3 轉化條件的優化

在轉化介質液總體積為30 mL，菜籽油濃度為7.5 mg/mL，脂肪酶［5］的加入量為 2 mg/30 mL 基礎上，將依次對轉化液介質的成分、介質濃度、pH、溫度、時間、細胞濃度、金屬離子［6］7個因素進行研究。

1.2.3.1 轉化介質及其濃度對CLA產量的影響

以0.1 mol/L pH 7.0的4種不同成分緩沖液作為轉化液介質，即(1)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液［7］、(2)Na2HPO4-KH2PO4緩沖液、(3)K2HPO4-KH2PO4緩沖液［8］、(4)KH2PO4-NaOH緩沖液。轉化細胞濃度為30 mg/mL，37 ℃，80 r/min，轉化24 h，根據 CLA的生成量確定最適的轉化液介質。

使用濃度分別為:0.05、0.1、0.15、0.2 mol/L pH 7.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為轉化介質，轉化細胞濃度為30 mg/mL，37 ℃，80 r/min，轉化24 h，檢測在不同濃度的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中CLA含量，以確定最適轉化液介質濃度。

1.2.3.2 轉化液介質pH對CLA產量的影響

將收集到的細胞分別用 pH為:5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的 0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進行懸浮，細胞濃度為30 mg/mL，37℃，80 r/min，轉化24 h，檢測各個轉化液中的CLA含量，確定轉化液介質的最適pH值。

1.2.3.3 轉化溫度對CLA產量的影響

在已確定緩沖液介質和pH的轉化體系中，細胞濃度為 30 mg/mL，轉化溫度分別為:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 ℃，80 r/min，轉化 24 h，檢測各個轉化液中的CLA含量，確定最適轉化溫度。

1.2.3.4 轉化時間對CLA產量的影響

在已確定緩沖液介質和pH值的轉化體系中，細胞濃度為30 mg/mL，35℃，80 r/min，轉化反應時間分別為 16、20、24、28、32、36、40、44、48 h，檢測各轉化液中的CLA含量，確定最適轉化時間。

1.2.3.5 細胞濃度對CLA產量的影響

在已確定緩沖液介質和pH值的轉化體系中，將收集到的菌體細胞加入該體系中，至細胞終濃度分別為:8、15、20、30、40、50、70、100 mg/mL，35℃，80 r/min，轉化24 h，檢測各轉化液中的CLA含量，確定最適轉化細胞濃度。

1.2.3.6 金屬離子對CLA產量的影響

一般低濃度的金屬離子會促進亞油酸異構酶的活性，在已確定的反應體系中加入不同種類的金屬離子(Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+)，使其濃度分別為1、2 mmol/L，然后檢測各轉化液中CLA產量，與未添加金屬離子(H)的對照組轉化液中CLA產量比較。

1.2.4 響應面法［9］優化轉化工藝

根據單因素實驗的結果，選擇對亞油酸異構酶活性有顯著影響的4個因素，即時間、pH值、溫度、細胞濃度為自變量，以CLA產量為響應值，設計出4因素3水平的實驗設計方案，如表1。

表1 各因素水平編碼Table 1 Coding of factors and levels

1.2.5 共軛亞油酸的提取方法［10］

取2 mL轉化液放入帶蓋試管中，加入10 mL正己烷，使用快速混勻器混合6 min，然后使用離心機5 000 r/min離心3 min，分成上中下，3層，用移液槍吸除下層水相，加入2 mL蒸餾水，混勻1 min，洗掉水溶性物質，離心分層，棄掉下層水相，然后把剩下的有機相和乳化層使用裝有無水硫酸鈉的濾紙過濾、吸水干燥，定容至25 mL容量瓶中。

1.2.6 共軛亞油酸的檢測方法［11］

準確稱取共軛亞油酸標準品，用正己烷溶解，配制成梯度溶液，在室溫25℃下，以正己烷為參比溶液，檢測233 nm處吸光值，以CLA濃度為橫坐標，吸光值A233為縱坐標，建立CLA紫外檢測標準曲線，如圖1。

標準曲線的線性相關系數是0.999 5，為高度顯著，線性范圍是 1 ～7 μg/mL，檢測限 1 μg/mL;將從轉化液中提取到的正己烷溶液，以正己烷為參比，在紫外233 nm處檢測吸光值，然后按照標準曲線換算出CLA含量。

圖1 CLA紫外標準曲線Fig.1 Standard curve of CLA UV absorbance

2 結果與分析

2.1 轉化液介質及其濃度對CLA產量的影響

選用了4種不同成分緩沖液作為轉化液介質，即(1)檸 檬 酸-檸 檬 酸 鈉 緩 沖 液［7］;(2)Na2HPO4-KH2PO4緩沖液;(3)K2HPO4-KH2PO4緩沖液［8］、(4)KH2PO4-NaOH緩沖液。由圖2可以看出，最適轉化介質是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，CLA的生成量為104.78±6.2 μg/mL，這說明適量的Na+對嗜酸乳桿菌的亞油酸異酶活性有促進作用。圖3結果顯示，最適介質液濃度是0.1 mol/L，是由于離子濃度過低不適合進行酶反應，而高濃度的鹽溶液，則會產生破乳現象，使菜籽油和水乳化不夠充分，影響了酶反應。

圖2 轉化介質對CLA產量的影響Fig.2 Effect of conversion medium on the yield of CLA

2.2 轉化液介質pH對CLA產量的影響

由圖4可以看出，嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶在5.0 ～8.5 之間都有酶活性，這和 Keper［12］等的報道基本一致。Lin［13］等對嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的研究表明，酶在pH 5時活性最大。圖4結果顯示，酶雖在pH 5時有活性峰值，但最適pH值是6.5，CLA的生成量為191.31±2.6 μg/mL，可能與本文使用的乳酸桿菌靜息細胞進行轉化，底物是菜籽油而不是亞油酸有關。

圖3 介質濃度對CLA產量的影響Fig.3 Effect of medium concentration on the yield of CLA

圖4 pH對CLA產量的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of CLA

2.3 轉化溫度對CLA產量的影響

從圖5可以看出，適宜的轉化溫度在31～35℃之間，其中35℃為最佳溫度，CLA的生成量221.83±6.1 μg/mL。在20～30℃之間酶活力變化不大，超過40℃酶活嚴重失活，表明亞油酸異構酶熱穩定性差，這和曹建［14］等人的研究結果基本一致。

圖5 溫度對CLA產量的影響Fig.5 Effect of Temperature on the yield of CLA

2.4 轉化時間對CLA產量的影響

由圖6結果顯示，初始隨著轉化時間的延長，CLA產量不斷增加，當轉化至24h時，CLA產量達223.57±5.72 μg/mL，隨著時間的延長，產量開始減少。這是由于CLA易氧化、穩定性不高會造成產量的下降，因此，24 h是最適的轉化時間。

2.5 細胞濃度對CLA產量的影響

從圖7可以看出，當細胞濃度達到40 mg/mL時，CLA的產量趨于穩定，達到232.04±5.27 μg/mL，細胞濃度與菜籽油濃度(7.5 mg/mL)最適比例為 5.3∶1。

圖7 細胞濃度對CLA產量的影響Fig.7 Effect of cell concentration on the yield of CLA

2.6 金屬離子對CLA產量的影響

一般低濃度的金屬離子會促進亞油酸異構酶的活性，在反應體系中加入不同種類的金屬離子(Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+)，使其濃度分別為 1、2 mmol/L。結果如圖 8所示，1 mmol/L Ca2+和Cu2+對亞油酸異構酶活性有微弱促進作用，分別比對照組提高了0.35%和0.62%。2 mmol/L Zn2+和 Ca2+對亞油酸異構酶活性有較大促進作用，分別比對照組提高了2.40%和1.75%。Mg2+作用不明顯，Fe2+、Mn2+和Fe3+都表現出了抑制作用，Fe3+的抑制作用最強。Cu2+一般是酶活性的抑制劑，而1 mmol/LCu2+對酶活性起到促進作用，可能原因是微量Cu2+可以大幅度促進菜籽油水解，有利于酶反應的進行，2 mmol/L Cu2+則明顯起到了抑制作用。

圖8 金屬離子對CLA產量的影響Fig.8 Effect of metal ion on the yield of CLA

2.7 轉化工藝的優化

試驗設計與結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results

以CLA產量(Y)為響應值，運用Design－Expert 8.0.6對實驗數據進行多項式回歸分析，得到如下二次多項式:

Y=332.04+22.75A－13.42B+5.75C+5.42D+29.97AB+9.54AC－19.34AD－10.53BC+13.60BD+15.86CD－68.92A2－42.73B2－11.71C2－35.42D2。

回歸模型方差分析表如表3所示。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression equation

由回歸方程和回歸模型方差分析表3可以看出，此模型的 F值是 43.66，“Prob＞F”的 P值小于0.0001，表明該模型是有顯著性意義的，能較好的解釋CLA產量的變化，失擬項在P=0.05水平上不顯著(P=0.242 2＞0.05)。在所選的因素內，對CLA產量影響排序為:時間＞pH＞溫度＞細胞濃度。交互項AB、AD是極顯著性因子，AC無顯著性差異，說明時間和溫度沒有交互作用。由表4可看出，預測擬合度十分接近校正擬合度，說明模型是合理的，信噪比大于4為理想值，本模型信噪比是25.788，說明比值理想，本模型方程可以被用來解釋設計方案。

表4 數學模型的統計結果Table 4 Statistical results of regression model

2.8 響應面圖分析和最優轉化工藝的確定

回歸方程AB、AD交互項所做的響應面圖。

圖9 響應面圖分析Fig.9 The chart of response surface analyse

兩個圖的響應曲面都有著明顯的坡度，說明pH與時間，細胞濃度與時間都有著明顯的交互作用，這和回歸方程分析中的結果一致。

通過軟件分析給出最優方案和CLA產量預測值。最優轉化轉化工藝:A=25.2 h，B=6.36，C=36.78℃，D=42.16 mg/ml，在此條件下CLA產量的理論值是236.26 μg/ml，考慮到實際操作和CLA易氧化的情況，實際實驗中最優條件控制在A=25 h，B=6.5，C=36 ℃，D=40 mg/mL，在此條件下，通過 5次獨立的試驗，得到的CLA產量的實際值為230.12±7.52 μg/mL，試驗值與預測值擬合較好，說明回歸方程為轉化合成CLA提供了一個合適的模型，驗證了前述假定的可行性。

3 結論

本論文在菜籽油濃度為7.5 mg/mL，脂肪酶的加入量為2 mg/30 mL條件下，對嗜酸乳桿菌靜息細胞轉化菜籽油生成CLA條件進行了優化研究。通過單因素試驗，確定了最適轉化液介質是0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，得到了最適pH、溫度、轉化時間和細胞濃度參數。同時，研究了不同金屬離子對亞油酸異構酶活性的影響，1 mmol/L Ca2+和 Cu2+對亞油酸異構酶活性有微弱促進作用，分別比對照組提高了0.35%和0.62%。2 mmol/L Zn2+和 Ca2+對亞油酸異構酶活性有較大促進作用，分別比對照組提高了2.40%和1.75%。在該基礎上，利用Box-Benhnken中心組合設計和響應面法對轉化時間、pH值、溫度、細胞濃度進行了工藝優化分析，確定了最優轉化時間25 h，pH6.5，溫度36℃，細胞濃度40 mg/mL。在此優化條件下，CLA的產量可以達到(230.12±7.52)μg/mL。通過這個數據可以看出嗜酸乳桿菌轉化菜籽油生成CLA是可行的，但CLA產量還有待于提高。今后我們可以通過誘變育種、細胞透性處理、酶激活劑等方法進行深入研究，使CLA產量更高。同時，結合固定化技術使細胞態的亞油酸異構酶可以得到重復、多批次利用，達到高效率、低成本生產的目的。另外，結合紅外光譜法，高效液相色譜法，氣相色譜法和質譜分析法，對CLA異構體和含量進一步分析，確定活性異構體的含量，為我們以后的研究奠定基礎。

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