真姬菇多糖HMP-1的分子結構特性及其生物活性*

包鴻慧，周睿，愈商權

1(黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶，163319)2(韓國江陵原州大學海洋生物科技學院，韓國，江源江陵，210702)

真姬菇又名蟹味菇、玉蕈、海鮮菇等，口感佳，具有獨特的蟹香味，在日本有“香在松茸、味在玉蕈”之說，是著名的珍稀食用菌，具有防止便秘、抗癌、防癌、提高免疫力、預防衰老、延長壽命等獨特功效。

真菌多糖普遍具有潛在的抗癌和免疫活性，荷葉離褶傘的水溶性多糖具有促進腹膜巨噬細胞增值和抑制腫瘤生長的作用，推斷其抗癌活性是通過調控寄主的免疫防御系統而產生［1］。然而，Lavi等人報道，從糙皮側耳中提取的多糖對HT-29癌細胞具有直接的細胞毒性，這種對癌細胞的細胞毒性是通過產生促凋亡因子Bax和細胞色素C而實現的［2］。真菌多糖的抗癌和免疫活性與其分子結構和超微構效有非常密切的關系，對多糖的結構鑒定和抗癌免疫活性的研究是非常重要的［3］。我國引進真姬菇較晚，對真姬菇多糖的研究，自2007年才見報道，并且大部分是對粗多糖提取工藝的研究［4－8］。目前國內對真姬菇相應的藥理活性研究也主要針對粗多糖，難以進行量效關系測定，且僅限于抗氧化活性［9］和抑菌活性［10］。本文分離純化真姬菇多糖，并對純化后的多糖的分子結構特性和抗癌免疫活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

真姬菇，購于上海大山合菌物科技股份有限公司;醋酸纖維素膜，英國沃特曼公司產品;糖標樣:葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖，Fluka公司產品;DEAE sepharose fast flow離子交換樹脂，Phamacia公司產品;胎牛血清、RPMI－1640培養基，美國Gibco公司產品;水溶性四唑鹽(WST－1)，瑞士Roche公司產品;Raw 264.7細胞、人胃腺癌細胞(AGS)、結腸腺癌細胞(DLD－1)、子宮頸癌細胞(HeLa)，美國標準生物品收藏中心(ATCC);其余試劑均為國產分析純。

R200－旋轉蒸發器，瑞士布齊公司;高效液相色譜(配置2414示差折光檢測器)，美國Waters公司;Bruker Agilent 6890N氣譜質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司;十八角激光光散射儀(MALLS)及ASTRA 5.3工作站，美國Wyatt技術公司;EL－800酶聯檢測儀，美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 真姬菇子實體粉的預處理

去雜、烘干(60℃，24 h)、粉碎、過篩(＜0.5 mm)、備用。

1.2.2 真姬菇子實體多糖的提取純化

稱取真姬菇子實體粉末100 g，加入體積分數80%乙醇，于60℃水浴回流脫脂2h，殘渣中加適量水(水料比1∶20)，100℃水浴提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，加入三氯甲烷-正丁醇(體積比4∶1)，充分振蕩30 min，離心，取上層水相重復除蛋白10次以上，去除游離蛋白。取上清液裝入透析袋內，透析，濃縮，真空冷凍干燥，即得真姬菇粗多糖(HMP)。

溶解真姬菇多粗糖HMP，上樣后分別用蒸餾水及不同濃度NaCl溶液洗脫，流速1.5 mL/min。收集洗脫液(30 min/管)，用硫酸苯酚法檢測［11］，合并相同流分，濃縮，透析，真空冷凍干燥，得不同多糖級分。

1.2.3 化學組成和單糖含量的測定

總糖和蛋白含量分別采用硫酸苯酚法［11］和Lowry法檢測［12］。單糖含量采用HPLC系統測定，糖分析色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動相為乙腈與水混合物 (體積比80∶20)，流速2 mL/min。

1.2.4 真姬菇多糖的均一性和平均分子質量測定

采用高效分子排阻色譜法(HPSEC)對真姬菇多糖進行均一性及分子質量的測定。溶解多糖，醋酸纖維素膜 (3.0 μm pore size)過濾，注入 HPSECMALLS-RI-UV系統，高效凝膠排阻色譜為3個色譜柱串聯:TSK G5000 PW(7.5 mm ×600 mm)、TSK G3000 PWxl(7.8 mm ×300 mm)、TSK G2500PWxl(7.8 mm ×300 mm)，流動相:0.15 mol/L NaNO3和0.02%NaN3，流速:0.4 mL/min。多糖的平均分子量可根據MALLS和RI檢測器收集的數據，通過ASTRA 5.3 軟件直接計算［13］。

1.2.5 糖苷鍵連接方式分析

多糖經甲基化處理后［14］，衍生物注入氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)檢測。色譜柱為HP-5柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫條件:初始溫度/停頓時間為160℃/2 min，程序升溫終止溫度/停頓時間240℃/10 min，升溫速率5℃/min。

1.2.6 對癌細胞的抑制作用

取對數生長期的人胃腺癌細胞(AGS)、結腸腺癌細胞(DLD－1)、子宮頸癌細胞(HeLa)，以1×105個/mL的細胞懸液接種于96孔培養板，置37℃、5%CO2培養箱培養24 h后吸取上清液棄去，加入真姬菇多糖樣品，每個濃度設3個平行，培養48 h，加入WST－1，450 nm下測OD值，計算癌細胞抑制率:

其中，As是實驗組OD值;Ac是空白對照組OD值。

1.2.7 真姬菇多糖對巨噬細胞的增值作用

在96孔培養板中加入巨噬細胞Raw 264.7(1×105個/mL)和不同濃度的多糖溶液，在CO2培養箱中培養72 h，RPMI－1640(含10%胎牛血清)為培養基?？瞻讓φ占由睇}水。增值作用采用WST－1法，計算免疫細胞增值率:

其中，As是實驗組OD值;Ac是空白對照組OD值。

1.2.8 真姬菇多糖對巨噬細胞NO釋放的影響

取對數生長期的巨噬細胞，調整細胞濃度至1×106個/mL，接種于96孔細胞培養板，于37℃，5%CO2條件下培養，待細胞貼壁后，棄掉培養上清液，加入多糖溶液或LPS(1 μg/mL，陽性對照)。培養24 h，取細胞培養上清液與等體積的Griess試劑混合，反應10 min，酶標儀540 nm測吸收值。NO濃度參考NaNO2(1～200 μmol/L)標準曲線計算。

1.2.9 數據處理

2 結果與分析

2.1 真姬菇多糖的分離純化

真姬菇子實體粉末經水提取、醇沉、Sevag法脫蛋白得真姬菇子實體粗多糖(HMP)，HMP進一步經DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離純化，DEAE-Sepharose Fast Flow不僅具有離子交換功能，還具有較快的洗脫速度和良好的分子篩效應，對真姬菇多糖的洗脫曲線如圖1所示，該粗多糖被分離為3個組分，將洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥得白色絮狀多糖HMP-1、HMP-2、HMP-3。

圖1 真姬菇多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow色譜分離曲線Fig.1 Elution pattern of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus on DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography

2.2 化學組成與單糖成分的測定

對純化后真姬菇多糖化學成分分析可知HMP-1和HMP-2含糖量分別為99%和98%，其余為蛋白，蛋白含量非常少。HMP-3為蛋白多糖，含糖量為65%。本實驗首先對HMP-1的分子結構和活性進行了研究。單糖分析結果表明，HMP-1由葡萄糖和半乳糖組成，其中葡萄糖含量為67.36 mg/g;半乳糖含量為33.36 mg/g。與真姬菇同屬的菌核側耳和平菇的水溶性多糖也主要由葡糖糖(73.1%～97.0%)和半乳糖(0.5% ～4.3%)組成［15－17］，其他單糖如果糖、木糖、甘露糖等在本研究中沒有發現。

2.3 HMP-1的均一性及分子質量測定

多糖的純度不能以通常小分子化合物的純度標準來衡量，它是一種生物高分子化合物，存在微觀的不均一性。真姬菇多糖HMP-1的均一性及分子質量采用高效分子排阻色譜法(HPSEC)進行分析。從RI和UV檢測器得到的色譜圖可知(圖2)，HMP-1在HPSEC上得到一個單一對稱峰，說明HMP-1為均一多糖組分。同時，HMP-1在系統中沒有明顯的UV反應值檢出，說明其蛋白含量非常低，這與HMP-1的化學組成檢測結果(蛋白含量1%)相一致。經MALLS技術測定HMP-1的平均分子量(Mw)為(4 781±0.6)ku。HMP-1的回旋半徑值(Rg)也通過MALLS計算出來以評估其分子尺寸，為(17.1±1.6)nm。從不同蘑菇中提取的水溶性多糖分子質量之間差異比較大，從1.1 ×104～3 900 ×104g/mol不等［18－19］，這種巨大的差異不僅是由于蘑菇種類不同，也與提取純化方法，分析檢測技術及蘑菇所處的生長周期不同有關。

圖2 RI檢測儀檢測的HMP-1分子排阻色譜圖Fig.2 HPSEC chromatograms of HMP-1 from RI detector

2.4 糖苷鍵連接方式分析

HMP-1經甲基化，酸水解、還原及乙?；?，生成甲基化糖醇乙酸酯衍生物，對其進行GC-MS分析，總離子圖(TIC)如圖3所示，質譜電離方式為EI源，1～5號峰相對應的質譜圖如圖3所示。

甲基化產物的GC-MS分析結果(表1)顯示，甲基化糖醇衍生物中占絕大部分的為2，3，6－Me3－Glcp，這說明多糖HMP-1分子的主鏈可能主要是通過1，4糖苷鍵連接的葡糖糖組成。一種經DEAE-纖維素柱層析純化的真姬菇多糖HPS-II也以(1，4)葡聚糖為主鏈，與我們的研究結果一致，雖然純化方法不盡相同［20］。同時由于衍生物中也有相當一部分的2，3，4-Me3-Galp，說明其主鏈也包含了 1，6 糖苷鍵連接的半乳糖。在真姬菇同屬的菌核側耳和環柄側耳多糖也由(1，4)葡萄糖構成主鏈，同時包含(1，6)葡萄糖或者半乳糖分支，與本課題組發現的結構相似［21－22］。

表1 HMP-1的GC-MS甲基化分析結果Table 1 Methylation analysis of HMP-1

2.5 抗癌活性測定

HMP-1對AGS、DLD-1、HeLa癌細胞的體外抑制率見表2。由表2可見，HMP-1對AGS、DLD－1、He-La的抑制率相對比較低(＜20%)而且無劑量依賴性。說明HMP-1對這3種癌細胞沒有明顯的細胞毒性。Ikekawa等人也曾報道過體外實驗中真姬菇粗多糖對L-5178Y腫瘤細胞幾乎沒有細胞毒性［23］，與我們的研究結果吻合。菌核側耳多糖和香菇多糖也對Sarcoma 180細胞和人肝癌細胞(HepG2)的體外抑制率(11% ～28%)較低［24－25］。然而，盡管體外抗癌活性低，真姬菇粗多糖和金福菇多糖在體內實驗中表現出了高抗癌活性［23，26］。對于這些多糖為什么只在體內表現抗癌活性，目前機理并不明確，然而有跡象表明多糖可能是作為生物反應調節劑，通過刺激免疫細胞產生NO或者細胞因子來抑制癌細胞的生長［23，27］。

2.6 真姬菇多糖對巨噬細胞的增值作用

小鼠巨噬細胞Raw264.7在LPS的刺激下會釋放細胞因子，這一系統被用于測定某種成分是否對免疫系統具有調節活性［28］。因此，本實驗以小鼠巨噬細胞 Raw264.7為細胞模型，考查了 HMP-1對Raw264.7細胞增殖及NO生成的影響，為活性多糖的免疫調節研究提供有價值的參考模式。本實驗的研究發現，含有HMP-1(1～200 μg/mL)的培養孔中，培養基顏色清澈，細胞透亮，長勢良好。WST-1結果(圖4)表明，HMP-1可促進Raw264.7細胞的增值，HMP-1對Raw264.7無細胞毒作用。

圖3 HMP-1的總離子流圖譜和部分甲基化糖醇乙酸酯的質譜圖Fig.3 Chromatogram of HMP-1 on GC-MS total ion flow and Mass spectra of partially methylated alditol acetates of HMP-1

表2 HMP-1對人細胞株的體外抑制作用Table 2 Anti-proliferative activity of HMP-1 in AGS cell lines

圖4 HMP-1對Raw264.7增值率的影響Fig.4 Effect of HMP-1 on cell proliferation of Raw264.7 cells

2.7 真姬菇多糖對巨噬細胞NO釋放的影響

HMP-1對Raw264.7細胞中NO釋放的影響如圖5所示，由結果可知，巨噬細胞在不添加任何成分，也就是在靜息狀態下，釋放的NO很少。添加HMP-1后，Raw264.7分泌NO的能力明顯提高(P＜0.01)，生成的NO的量隨HMP-1劑量的增加而增加，呈劑量依賴關系。當 HMP-1在濃度為100 μg/mL時，Raw264.7生成NO 的量為31.94 μmol/L，與 LPS中Raw264.7生成NO的量相似。NO水平是巨噬細胞激活的一個重要指標，巨噬細胞抗病毒、抗腫瘤、抑制胞內病原體增值等作用主要都是通過釋放NO實現［29］。HMP-1顯著增加了巨噬細胞釋放 NO的能力，說明HMP-1是巨噬細胞免疫調節物質，具有免疫調節活性。

圖5 HMP-1對巨噬細胞Raw264.7中NO的影響Fig.5 Effect of HMP-1 on NO production in mouse peritoneal macrophage Raw264.7 cells

3 結論

從真姬菇中提取生物活性成分真姬菇多糖，經離子交換柱層析分離純化得到組分HMP-1;HMP-1主要由葡萄糖和半乳糖構成，分子質量為(4 781±0.6)ku，分子回旋半徑值為(17.1±1.6)nm;經甲基化和GC-MS初步分析其結構，HMP-1主鏈為(1，4)葡萄糖，含有(1，6)半乳糖分支;體外實驗表明，HMP-1雖對AGS、DLD-1和HeLa癌細胞無明顯的細胞毒性，但對小鼠巨噬細胞有明顯的激活作用，具有免疫活性，可以作為免疫調節劑應用于醫藥、衛生或者保健食品中。今后將對HMP-2和HMP-3的結構和活性進行檢測，以期對真姬菇多糖的結構和活性之間的關系進行研究。

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