水產品中副溶血性弧菌實時熒光PCR檢測方法

李秋陽，馬師良，呂雨莎，韓玥，張惠媛

(北京出入境檢驗檢疫局，北京，100621)

副溶血性弧菌是目前受到國內外重視的一種在海產品中常見的病原菌，是食品安全監管過程中需要重點監測的對象，也是海產品類食品易感染的常見致病菌之一。人們食用被副溶血性弧菌污染的食物后極可能引起急性腸胃炎和原發性敗血癥等［1］。

目前，我國水產品中副溶血性弧菌的檢測方法主要以傳統方法為主，檢測周期為3～5d，耗時長，工作繁重。雖然一些行業標準中有關于普通PCR和熒光PCR方法檢測副溶血性弧菌，但截至目前為止還尚未有成熟、穩定的標準方法。

研究表明，副溶血性弧菌的主要致病性源于侵襲性、溶血素和脲酶［2］。溶血素是副溶血性弧菌的主要致病因素，目前研究較多的是耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、耐熱直接溶血素相關溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)和不耐熱溶血素(thermolabile hemolysin，TLH)。TLH、TDH和TRH分別由tlh、tdh和trh基因編碼。tlh基因具有種特異性，不論是環境分離株還是臨床分離株都攜帶該基因。目前認為，tdh和trh基因是副溶血性弧菌的毒力基因。環境分離株極少攜帶tdh或trh基因，因此，自然界中非致病性的副溶菌極為普遍;而臨床分離株通常攜帶tdh或trh基因，或二者兼有［2－3］。

實時熒光PCR技術以其特異性強、靈敏度高、快捷、簡便、易操作等突出優點，解決了快速檢測副溶血性弧菌的難題。本研究確立的副溶血性弧菌的特異性tlh、tdh、trh基因引物、探針和反應體系，旨在驗證本研究確立的方法對水產品中的副溶血性弧菌是否具有特異性、靈敏性和穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

熒光PCR引物和探針，生工生物工程(上海)有限公司合成;TaqMan Environmental Master Mix 2.0，購自美國AB公司。

1.1.2 主要儀器

實時熒光定量PCR7500，購自美國AB公司。

1.1.3 實驗菌株

實驗所用菌株及菌株來源如表1所示。

表1 實驗菌株及菌株來源Table 1 Experimental strains and strain sources

1.1.4 引物、探針的設計與合成

通過查閱文獻確立的tlh、tdh、trh的基因序列和探針，由生工生物工程(上海)有限公司合成引物序列。引物序列如表2。

表2 實驗引物與探針Table 2 Experimental primer probe

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株復蘇

挑取少許－80℃保存的上述實驗菌株的分離株于TSA或T1N1平板上，36℃培養18～24 h。

1.2.2 反應體系及其程序［5］

反應總體積為 25 μL，含模板 3 μL，2 × TaqMam Environmental Master Mix:12.5 μL，0.6 mol/L 上、下游引物各 1.5 μL，10 μM 探針:0.3 mol/L，ddH2O:5.75 μL。反應參數為:50℃，2 min，95℃ 預變性 10 min，45 個循環中 95℃變性 20 s，56℃退火 31 s，退火階段采集熒光信號。

1.2.3 特異性檢測

1.2.3.1 模板DNA的提取

以無菌操作挑取少許副溶血性弧菌10126(已用普通PCR法檢測其含tlh、tdh、trh基因)和1.1.3表1中7～12號標準菌株的新鮮過夜培養物，分別溶于200 μl的TE緩沖液，沸水浴5 min，－20℃保存待用。

1.2.3.2 特異性檢測

以無菌操作分2次分別吸取10 μL上述已提取DNA模板的菌液制成混合菌液，制成2種不同的混合菌液，其中一種是含有副溶血性弧菌DNA模板的混合菌液，另一種是不含有副溶血性弧菌DNA模板的混合菌液，且使用表2的引物和探針，采用1.2.2的反應體系進行實時熒光PCR的實驗。

1.2.4 靈敏性試驗

1.2.4.1 計數

選用6株副溶血性弧菌標準菌株和自分離株(表1的1～6號)的新鮮過夜培養物，經堿性蛋白胨水增菌(36℃，18～24 h)后，調節菌液濃度達到約0.5 OD，進行10倍梯度稀釋。選取適宜稀釋度(1×10－3～1×10－7)的稀釋液，依次吸取100 μL菌液，涂布于 T1N1平板上，36℃培養18～24 h后，進行平板計數。

1.2.4.2 副溶血性弧菌純培養物最低檢出限的測定選取適宜的2個連續稀釋度下的平板計數的結果，利用菌落總數的計算方法，按公式

式中:N，樣品中菌落數;∑C，平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和;n1，第1稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;n2，第2稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;d，稀釋因子(第1稀釋度)。

結合相對應的實時熒光PCR的結果，確定該熒光PCR方法的最低檢出限。

1.2.4.3 梯度稀釋液的熒光PCR檢測

選取副溶血性弧菌適宜稀釋度(1×10－3～1×10－7)的稀釋液，各 1 000 μL，10 000 r/min 離心 10 min，棄上層清液后，溶于100 μL的TE緩沖液，沸水浴5 min。使用表1合成的引物和探針，采用1.2.2的反應體系進行實時熒光PCR。

1.2.5 副溶血性弧菌熒光PCR重復性的檢測

取副溶血性弧菌10126在1次試驗中重復20次，觀察其tlh、tdh、trh基因的Ct值的變異系數。同時取該菌在20次不同的試驗，觀察tlh、tdh、trh基因Ct值的變異系數。

2 結果

2.1 特異性分析

對7株試驗菌株及其制成的2種不同混合液，共計9個樣品，同時進行實時熒光PCR檢測。結果表明，副溶血性弧菌10126和含有副溶血性弧菌10126的DNA模板的混合菌液出現擴增曲線，為陽性;而溶藻弧菌(VA)、霍亂弧菌(VC)、大腸桿菌(ECO)、沙門氏菌(SLM)、金黃色葡萄球菌(SA)，單核細胞增生李斯特氏菌(LMO)及其制成的混合液、空白對照均未產生擴增曲線，為陰性(圖1)。實驗結果表明，該實時熒光PCR檢測方法的特異性良好。

2.2 靈敏度與最低檢出限的確定

菌懸液經梯度稀釋后，通過平板計數的方法，結合適宜稀釋區間(1×10－3～1×10－7)內的實時熒光PCR的結果，確定每個標準菌株使用該方法分別檢測出含有tlh、tdh、trh基因時的檢測限，多次重復后確定每株菌檢出tlh、tdh、trh基因時菌液濃度的區間和最低檢出限(見表3)。

圖1 副溶血性弧菌熒光PCR檢測的特異性Fig.1 Vibrio parahaemolytichus real time PCR for the detection of soecific

表3 各標準菌株的tlh、tdh、trh基因的檢出范圍及平均值Table 3 Various standard strains of tlh，tdh，trh gene detection range and the average

2.3 重復性試驗結果

對同一樣品在同一次試驗和不同試驗間獲得的tlh、tdh、trh基因的Ct值進行統計，同一次試驗內的20個平行樣品的tlh、tdh、trh基因的擴增曲線在閾值線附近基本上重合(圖2)，Ct值平均讀數分別為16.8，25.06，27.12;標準差分別為0.24，0.24，0.41;變異系數分別為1.40%，0.96%，1.50%。同一樣品在不同20次試驗中所獲得的tlh、tdh、trh基因的Ct值也基本相同，Ct值平均讀數分別為17.32，23.89，25.82;標準差分別為0.46，0.80，1.07;變異系數分別為2.70%，3.30%，4.10%。

圖2 重復性試驗分別檢測tlh、tdh、trhFig.2 Repeatability test detected tlh、tdh、trh

3 討論

在特異性實驗中，同時擴增了副溶血性弧菌和其他6株常見食源性致病菌及其混合液，僅副溶血性弧菌和添加了副溶血性弧菌的6株致病菌的混合菌液有擴增曲線，說明本研究建立的方法特異性良好。

在靈敏度的實驗中，當菌液的濃度達到6～43 CFU/mL時，即可檢出樣品中副溶血性弧菌是否含有tlh基因;當菌液的濃度達到97～1 700 CFU/mL時，即可檢出樣品中副溶血性弧菌是否含有tdh基因，當菌液的濃度達到1 100～4 000 CFU/mL時，即可檢出樣品中副溶血性弧菌是否含有trh基因。該方法大大縮短了檢測過程，這是包括傳統的平板分離培養，常規PCR在內的其他方法無法比擬的。而且該方法選擇了種特異性基因和毒力基因，不僅能夠鑒別出分離株是否是副溶血性弧菌，還能夠進一步判別其是否潛在致病性。在每個菌株中，因其致病基因拷貝數的多少不同，故其3種基因檢出限會存在一定差別。當然上述結果都是在沒有背景菌干擾的情況下得出的，在天然樣品中其檢出限也會存在一定差異。

將此檢測方法與行業標準SN/T1870－2007《食品中致病菌檢測方法 實時PCR法》的方法進行比較，僅就種特異性tlh基因而言，結果顯示該方法的靈敏性高于行業標準SN/T1870－2007中的副溶血性弧菌200 CFU/mL的最低檢出限。毒力基因tdh和trh基因在該行業標準中沒有明確地說明其檢測限。

雖然運用實時熒光PCR技術對副溶血性弧菌中含有的tlh基因或tdh基因的靈敏性、特異性檢測已有報道，但運用實時熒光PCR技術對副溶血性弧菌中是否含有tlh基因，tdh基因和trh基因3種致病基因的靈敏性、特異性和重復性檢測研究還比較少。

針對檢測副溶血性弧菌的3種毒力基因所建立的熒光PCR檢測方法進行的2組重復性試驗，其變異系數值均較小，小于5%，表明本實驗所建立的方法具有較高的重復性，良好的穩定性，可對副溶血性弧菌及其致病基因進行可靠的檢測。

對實驗中選用的標準菌株進行溯源，驗證實驗結果的可靠性。登陸“中國普通微生物菌株保藏管理中心”網站，標準菌株1.1997溯源到ATCC17802，標準菌株1.1615溯源到ATCC 33846。登陸“美國國立生物技術信息中心 NCBI”網站，可查閱到ATCC17802攜帶trh基因、ATCC 33846攜帶 tdh基因。以上對標準菌株的溯源，證明該方法對標準菌株的檢測結果是準確的。

本研究對已建立的副溶血性弧菌實時熒光PCR的檢測方法進行了驗證，證明該方法不僅具有特異性強、靈敏度高、穩定性好、操作簡便等優點，而且不受產物污染和交叉污染等因素影響，特別適用于需要快速通關的進出口水產品檢驗，同時也為快速檢測水產品中副溶血性弧菌提供了一個更科學有效的新方法。

［1］ 劉琦，周德慶，柳淑芳，等.PCR快速檢測水產品中副溶血性弧菌的方法研究［J］.食品科學，2008，29(11).

［2］ Taniguchi H，Hirano H，Kubomura S，et al.Comparison of the nucleotide sequences of the genes for the thermolabile hemolysin from Vibrio parahaemolyticus［J］.Microb Pathogen，1986，1(5):425 －432.

［3］ Nishibuchi M，Kaper J B.Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus:a virulence gene acquired by a marine bacterium ［J］.Infect Immun，1995，63(6):2 093－2 099.

［4］ Davis C R，Heller L C，Kealy Peak K，et al.Real-Time PCR detection of the thermostable direct hemolysin and thermolabile hemolysin genes in a Vibrio parahaemolyticus cultured from mussels and mussel homogenate associated with a food borne outbreak［J］.Journal of Food Protection，2004，67(5):1 005 －1 008.

［5］ Jessica L Nordstrom，Michael C L Vikery，George M Blackstone，et al.Development of a multiplex real-time PCR assay with an internal amplification control for the detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteriain oysters［J］.Applieda Environmental Microbiology，2007，73(18):5 840－5 847.