南極磷蝦粉中蝦青素的提取*

孫來娣，高華，劉坤，孫偉紅，邢麗紅，苗鈞魁，冷凱良

1(中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島，266071)2(青島大學醫學院，山東青島，266021)

南極磷蝦粉是以南極磷蝦為原料，經蒸煮、壓榨、烘干、粉碎等工序制成的具有獨特營養功能和質量屬性的水產動物飼料［1］。由于含有豐富的優質蛋白、氨基酸、天然色素蝦青素、礦物質元素以及低脂肪等，其在水產飼料中的應用越來越廣泛，并發揮著不可比擬的優勢［2－5］。有資料顯示，南極磷蝦粉中蝦青素含量在100～300 mg/kg［6］，其對水產動物可以起到強免疫、著色、保鮮的作用，是1種重要的魚類生長調節劑［7－8］。目前有關蝦青素提取測定方法的研究主要集中在紅球藻和紅發夫酵母菌上，而有關南極磷蝦蝦青素的提取測定的研究報道甚少。

目前提取蝦青素最常用的方法是溶劑萃取法，該法工藝提取條件簡單。本課題以南極磷蝦粉為原料，研究了溶劑浸提法提取蝦青素的實驗條件，考察了提取溶劑、提取溫度、料液比、提取時間等因素對蝦青素含量的影響，并結合響應曲面法優化了蝦青素提取方法，以期為南極磷蝦的產業化開發利用提供科學依據。同時，本實驗采用分光光度法測定磷蝦粉中的蝦青素，通過借鑒美國FDA法計算蝦青素含量。FDA公式計算法由于具有操作簡便、無需標準對照品、數據真實可靠等優點，與外標一點法和標準曲線法相比具有明顯的優勢，這為快速簡便地測定磷蝦粉中的蝦青素提供了基礎［9－11］。

1 實驗材料與方法

1.1 試驗材料

UV-2000紫外-分光光度計，尤尼柯儀器有限公司;BSA224S-CW分析天平，賽多科斯科學儀器有限公司;CR22G高速冷凍離心機，日本Hitachi公司;N-EVAP112氮吹儀，美國 Organomation公司;ISRDS3恒溫振蕩器，美國精湛有限公司;渦旋混合器，無錫活信儀器有限公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亞砜(DMSO)、丙酮、2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)等有機試劑。

南極磷蝦粉樣品，由遼寧遠洋漁業有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取測定方法

將南極磷蝦粉粉碎并過100目篩網，得到粗細均勻的粉末。準確稱取上述粉末0.5 g，按一定料液比(mL∶g)加入二氯甲烷-甲醇(體積比 1∶3)溶液，于設定溫度下恒溫浸提一定時間。取出流水冷卻后，5℃、8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液氮氣吹干，然后用DMSO溶解并定容至5 mL，以DMSO為參比溶液，于489 nm下測定吸光度值。

1.2.2 含量計算方法［9］

南極磷蝦粉中蝦青素的含量計算采用美國食品藥品監督管理局(FDA)提供的方法，其具體計算公式為:

式中:X為蝦青素的總含量，%;A489為489 nm下的吸光度值;V為提取樣品的體積，mL;f為稀釋倍數;1908為消光系數;m為所稱取的南極磷蝦粉質量，g。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素實驗

在保持其他條件不變的情況下，分別考察提取溶劑、提取溫度、提取時間、料液比等主要因素對蝦青素提取效果的影響，具體的單因素實驗設計見表1。

表1 南極磷蝦粉中蝦青素提取單因素試驗Table 1 Univariate experiments for extracting astaxanthin from Antarctic krill powder

1.3.2 響應曲面優化法實驗設計［12－13］

在單因素實驗基礎上，采用Box-Behnken設計數學模型，確定二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)為提取溶劑，選取提取溫度、料液比、提取時間3個對蝦青素提取效果影響顯著的因素，分別以A、B和C為代表，每個自變量的低、中、高試驗水平分別以－1、0、1進行編碼。以蝦青素的含量(Y)為響應值，對南極磷蝦粉中蝦青素的提取方法進行三因素三水平優化實驗設計，利用Design-Expert 7.0軟件進行數據處理和回歸分析。具體的試驗因素與水平設計見表2。

表2 響應面分析因素與水平Table 2 Variables and levels in response surface design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溶劑對蝦青素提取效果的影響

由圖1可知，以混合試劑二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)為提取溶劑，所得樣品溶液的含量最大，而以乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亞砜(DMSO)為提取溶劑的提取效果相當。這是因為蝦青素是弱極性化合物，根據相似相容原理其在弱極性溶劑二氯甲烷中的溶解度較大;另外，較單一溶劑而言，復合溶劑則更易深入蝦粉組織細胞內將結合在組織細胞中的蝦青素充分浸提出來，從而使得提取效果顯著。

同時，本實驗還考察了不同配比的二氯甲烷和甲醇對提取效果的影響。結果發現，隨著二氯甲烷比例的增加，蝦青素含量變化并不明顯，高比例的二氯甲烷反而使樣品中的脂質成分被不同程度地浸提出來，導致溶液的渾濁度增加，這給樣品溶液的濃縮、測定帶來干擾。因此，綜合考慮各因素，實驗選擇二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)為提取溶劑進行后續研究。

圖1 提取溶劑對蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.1 Effect of extraction solvent on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.1.2 提取溫度對蝦青素提取效果的影響

由圖2可知，在20～50℃內，隨著提取溫度的升高，蝦青素含量呈逐漸上升的趨勢，在50℃時蝦青素含量達到最高;隨后，隨著提取溫度的升高，蝦青素受熱易被氧化降解，致使其含量呈緩慢下降的趨勢。實驗在綜合考慮各因素的條件下，選擇50℃作為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.1.3 提取時間對蝦青素提取效果的影響

由圖3可知，在恒溫浸提60 min之前，蝦青素未能充分地轉移到溶液中，隨著提取時間的增加，蝦青素含量呈逐漸上升的趨勢，在60 min時蝦青素含量達到最高;之后，隨著浸提時間的增加，蝦青素含量呈明顯下降的趨勢。實驗在綜合考慮各因素的條件下，選擇60 min作為最佳提取時間。

圖3 提取時間對蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.3 Effect of extraction time on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.1.4 料液比對蝦青素提取效果的影響

由圖4可知，在30～60 mL/g內，隨著提取溶劑的增加，蝦青素含量呈逐漸增高，這是因為溶劑與原料間的濃度差越大，就越有利于目標物蝦青素的溶出，其提取效率也就越高，當料液比為60∶1(mL∶g)時蝦青素含量達到最大;隨后，蝦青素含量略有下降，表明提取基本完全。在綜合考慮各因素的條件下，選擇60∶1(mL∶g)作為適合的料液比。

圖4 料液比對蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.4 Effect of liquid/soild ratio on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.2 響應曲面實驗結果及方差分析

利用軟件Design-Expert 7.0進行試驗設計，本次試驗共有17個試驗點，分為兩類:其一是析因點，自變量取值在各因素所構成的三維頂點，共有12個析因點;其二是零點，為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差，并以蝦青素含量為響應值。Box-Behnken方案設計與響應曲面法實驗結果見表3。

表3 Box-Behnken方案設計與響應曲面法實驗結果Table 3 Design of Box-Behnken experiment and results of response surface methodology

利用Design-Expert 7.0軟件對表3實驗數據進行多元回歸擬合，得到南極磷蝦蝦青素含量(Y)對提取溫度(A)、料液比(B)和提取時間(C)的二次回歸模型為:Y= －473.30+5.54A+14.11B+2.11C+0.007 9AB－0.006 3AC－0.008 3BC－0.055A2－0.11B2－0.010C2。

2.3 模型顯著性檢驗

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表4。

由表4可知，模型的P＜0.01，表明回歸模型極顯著，可以用模型分析、預測南極磷蝦蝦青素提取方法結果;A、B、C、BC對蝦青素含量有著顯著影響，A2、B2、C2對蝦青素含量的影響達到極顯著水平。由F值可知，各因素對蝦青素含量的影響次序為:料液比二次項＞料液比一次項＞溫度二次項＞時間二次項＞溫度一次項＞時間一次項;此外，從方差分析結果可知，R2=0.990 3，表明該模型與試驗擬合較好。提取溫度、料液比、提取時間之間的相互作用見圖5～圖7。

通過軟件分析，得到蝦青素提取的最佳條件為:提取溫度51.41℃、料液比63.13∶1(mL∶g)、提取時間61.15 min。在此條件下，蝦青素理論含量為179.00 mg/kg。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化條件提取蝦青素，考慮到實際操作的便利，將提取參數修正為:提取溫度51℃、料液比63 mL/g、提取時間61 min。在此修正條件下提取得到的蝦青素平均含量為179.21 mg/kg，與理論預測值相比，其相對誤差小于l%。因此，基于響應曲面法所得的優化提取方法參數準確可靠，具有實用價值。

2.4 優化條件下提取不同南極磷蝦粉樣品中的蝦青素

實驗分別以市售南極磷蝦粉產品以及大連遼漁集團、山東科芮爾公司、青島?？ü咎峁┑哪蠘O磷蝦粉樣品為材料，在上述優化條件下分別提取蝦青素，測得的蝦青素含量見表5。

圖6 提取溫度與提取時間對蝦青素含量影響的響應面圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effect of extraction temperature and extraction time onastaxanthin content

圖7 料液比與提取時間對蝦青素含量影響的響應面圖Fig.7 Response surface and contour plots for the interactive effect of liquid/soild ratio and extraction time onastaxanthin content

表5 優化條件下提取所得南極磷蝦粉樣品中的蝦青素含量Table 5 Astaxanthin content of Antarctic krill powder samples under optimized extraction conditions

由表5可以看出，磷蝦粉樣品中的蝦青素含量在42～181 mg/kg，大多數樣品中的蝦青素含量低于100 mg/kg，分析原因可能是因為磷蝦粉在生產貯運過程中常暴露于空氣、光照下，其中的蝦青素已被不同程度地氧化降解，致使含量減少［14－15］;同時從檢測的結果還可以看出:即使是同一生產企業，其不同生產年限的磷蝦粉中的蝦青素含量也有顯著差異，分析原因可能是生產原料和加工工藝不同而使然。

3 結論

通過單因素實驗優化南極磷蝦蝦青素的提取條件，根據Box-Behnken設計法進行試驗設計并分析處理數據，最終通過響應面的分析得出最佳的蝦青素提取條件為:提取溫度51.41℃、料液比63.13∶1(mL∶g)、提取時間61.15 min，得到的理論含量為179.00 mg/kg。將方法條件修正后，實驗所得的蝦青素含量為179.21 mg/kg。通過響應面的分析結果可知，影響蝦青素含量的提取因素依次為:料液比＞提取溫度＞提取時間。同時，采用分光光度測定法和美國FDA提供的公式計算法能夠快速準確地測定、計算出蝦青素含量，適合于探索性試驗的大批量快速進行。

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