乳酸菌降解亞硝酸鹽的發酵條件研究

顧詩雯，何婷婷，2，丁少南，2，龔鋼明，*

（1.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234）

乳酸菌有促進營養分解、吸收，抑制腸道腐敗菌生長，調節腸道微生物菌群平衡降膽固醇，降血壓，抗腫瘤等保健功能，是人體健康的益生菌，在傳統食品及功能性食品加工中有著廣泛的應用。乳酸菌在發酵過程中還可產生一些特殊酶系[1-2]，例如亞硝酸鹽還原酶，它可以催化亞硝酸鹽還原。食品中如果亞硝酸鹽殘留超標可存在致癌的危害，當前，由于大量含氮化肥使用以及工業廢水的排放與灌溉，使不少蔬菜中亞硝酸鹽殘留污染較高。利用乳酸菌控制食品中亞硝酸鹽殘留超標已引起研究者關注。張慶芳等[3-4]對乳酸菌降解亞硝酸鹽機理的研究認為乳酸菌發酵產生的乳酸及亞硝酸還原酶都能起著降解亞硝酸鹽的作用。夏巖石等[5]比較了自然發酵與乳酸菌接種發酵豆角過程中降解亞硝酸鹽的動態，分析了不同發酵溫度和起始pH 條件下發酵液亞硝酸鹽含量的變化。周光燕等[6]研究了乳酸菌對泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量變化。研究結果都表明乳酸菌有明顯降解亞硝酸鹽的效果。

乳酸菌發酵降解亞硝酸鹽的影響因素較多，例如菌種、接種量、發酵溫度、起始pH、發酵時間、培養基成分等。目前，相關的研究還比較少。本文以番茄汁作為培養基，采用正交試驗設計研究番茄汁與水的比例，NaCl 添加量，培養時間，所接菌種與亞硝酸鹽降解的關系。實驗結果對于乳酸菌發酵蔬菜汁工藝中亞硝酸鹽殘留的控制與消除提供一定技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料及設備

材料：番茄（市售）；酪蛋白胨；牛肉膏；酵母粉；葡萄糖；均為生化試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司，乙酸鈉；檸檬酸二胺；吐溫80；K2HPO4；MgSO4·7H2O；MnSO4·H2O；CaCO3；瓊脂；硼酸鈉；乙酸鋅；亞鐵氰化鉀；鹽酸萘乙二胺；對氨基苯磺酸；亞硝酸鈉均為分析純購于國藥集團化學試劑有限公司。

PHSJ-4A 型PH 計：上海大中分析儀器廠；HH-S型水浴鍋：金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠；SYQ-DSX-280 型滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SHP-150 型CO2恒溫培養箱：上海精宏設備有限公司。

菌種：短乳桿菌（Lactobacius brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由上海應用技術學院香料香精技術學院分離并保存。

1.2 培養基

MRS 液體培養基：酪蛋白胨10.0 g；牛肉膏10.0 g；酵母粉5.0 g；葡萄糖5.0 g；乙酸鈉5.0 g；檸檬酸二胺2.0 g；吐溫80 1.0 g；K2HPO42.0 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；MnSO·4H2O 0.05 g；CaCO320.0 g。去離子水：1 000 mL，調節pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20 min（pH 測定采用PHSJ-4A 精密pH 計）。

番茄汁培養基：取新鮮番茄，洗凈，于95 ℃水中熱燙3 min，去皮，用組織搗碎機打漿，用2 層紗布過濾，所得濾液與適量蒸餾水混合后即得到番茄汁，與一定比例的蒸餾水混合，調節pH 至6.5，再加熱至90 ℃保持30 min，得番茄汁培養基，冷卻后備用。

1.3 菌種活化與培養

取菌種按4%接種量接種于裝有200 mLMRS 液體培養基250 mL 錐型瓶中，置培養箱，37 ℃培養20 h，得到種子菌種，備用。

1.4 番茄汁發酵培養

取250 mL 錐型瓶中加入200 mL 番茄汁培養基，再加入一定量的NaCl，接入相應的菌種，接種量為4 %，放置恒溫培養箱，37℃培養20 h，取出調pH 至6.5，加入一定量NaNO2，37 ℃發酵培養一定的時間，取樣測定NaNO2的量。

1.5 NaNO2標準曲線建立

稱取0.100 g 亞硝酸鈉于干燥器中干燥24 h，置入500 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻后從中取出5.00 mL，置于200 mL 容量瓶中，加水蒸餾水至刻度，得亞硝酸鈉母液。分別吸取亞硝酸鈉母液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 置 于50 mL 容量瓶中，各加入40 mL 蒸餾水，和2 mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再各加入1 mL 鹽酸萘乙二胺溶液，混勻后加水至刻度，避光靜置15 min，于540 nm 處測吸光值。以橫坐標為NaNO2的含量，縱坐標為吸光值，制作標準曲線[7]。

1.6 樣品測定

取5.0 mL 發酵液，置于250 mL 三角瓶中，加入12.5 mL 飽和硼砂液，攪拌均勻，再加入40 mL 蒸餾水，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫后加入5 mL 亞鐵氰化鉀溶液，混勻后加入5 mL 乙酸鋅溶液，混勻，靜置30 min，轉入100 mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻。過濾，收集濾液。取2.00 mL 濾液于50 mL 容量瓶中，加入40 mL 水，再加入2 mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再加入1 mL 鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，加水至刻度，避光靜置15 min，在540 nm 處測吸光值，另以5.0 mL 蒸餾水代替樣品液，做空白對照。根據標準曲線求得樣品NaNO2的含量[7]。

1.7 正交試驗設計

根據預實驗，選NaCl 添加量、番茄汁∶水、培養時間、乳酸菌菌種為影響因素，以亞硝酸鹽降解率為指標，進行正交試驗。每個因素選擇3 個水平，用L9（34）正交表設計進行實驗。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素和水平表Table 1 orthogonal factors and levels table

乳酸菌發酵液中NaNO2降解率按以下公式計算：

NaNO2降解率=（初始培養時NaNO2的含量-培養一定時間后NaNO2的含量）/（初始培養時NaNO2的含量）×100%

1.8 驗證實驗

按照正交試驗選擇的最佳提取工藝條件，重復進行3 次發酵實驗，并測定亞硝酸鹽降解率，評價正交試驗選擇的工藝條件是否穩定。從而得到最優化的發酵條件組合。

2 結果與討論

2.1 NaNO2標準曲線

根據1.5 實驗數據，繪制NaNO2標準曲線，求得曲線方程為：

2.2 正交試驗

按照表1 正交設計因素水平表進行乳酸菌番茄汁發酵。檢測NaNO2含量變化求得NaNO2降解率。試驗結果見表2。

極差分析結果表明，各因素對乳酸菌降解亞硝酸鹽的影響程度從高到低的次序為B＞C＞D＞A，即NaCl添加量＞培養時間＞菌種＞番茄汁∶水。最佳發酵工藝條件為A2B2C2D3。即NaCl 添加量4%，培養時間18 h，接菌種為4%植物桿菌，番茄汁∶水為1 ∶1 的條件。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

由從表2 可以看出NaCl 的添加量對于番茄汁發酵產亞硝酸鹽還原酶的量有顯著影響，這可能是因為Na+的存在與亞硝酸鹽還原酶的活性有一定關系，但是NaCl 濃度不能過高，否則會降低NaNO2的降解率，這與張慶芳等的文獻報導相符[8]。關于NaCl 對乳酸菌具體情況需要進一步研究。

2.3 驗證實驗

根據正交試驗選擇的最佳發酵條件，即A2B2C2D3的組合重復3 次實驗，驗證實驗結果是乳酸菌番茄汁發酵對NaNO2的平均降解率為92.08 %。

3 結論

本實驗采用正交設計法，以番茄汁為培養基，研究了番茄汁與水比例、NaCl 添加量、培養時間、發酵菌種對乳酸菌發酵降解亞硝酸鹽的影響。實驗確定了各因素次的主次順序為NaCl 添加量＞培養時間＞菌種＞番茄汁∶水。最佳發酵工藝條件是NaCl 添加量4%，培養時間18 h，菌種為的短乳桿菌，接種量4%，番茄汁∶水為1 ∶1。在此條件下進行了3 次重復實驗，結果顯示乳酸菌番茄汁發酵對NaNO2的平均降解率為92.08%。本實驗結果為深入研究乳酸菌降解亞硝酸鹽的發酵條件及探索純種發酵蔬菜汁工藝提供參考。

[1]楊潔彬等.乳酸菌的生物學基礎及應用[M].北京：中國輕工業出版社,1996：4-10

[2]龔鋼明,呂玉濤,管世敏,等.乳酸菌亞硝酸鹽還原酶制備及酶學性質[J].中國釀造,2011,31(1)：58-60

[3]張慶芳,遲乃玉,鄭艷,等.乳酸菌降解亞硝酸鹽機理的研究[J].食品與發酵工業,2002,28(8)：27-31

[4]張慶芳,遲乃玉,鄭學仿,等.短乳桿菌去除亞硝酸鹽的研究[J].微生物學通報,2004,31(2)：55-60

[5]夏巖石,孫春鳳.乳酸菌降解亞硝酸鹽的動態研究[J].湖南科技學院學報,2008,29(8)：44-46

[6]周光燕,張小平,鐘凱,等.乳酸菌對泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量變化及泡菜品質的影響研究[J].西南農業學報,2006,19(2)：290-293

[7]中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.33－2003.食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定[S].北京：中國標準出版社：259-265

[8]董碩,遲乃玉,張慶芳.氯化鈉對乳酸菌降解亞硝酸鹽的影響[J].中國釀造,2010(7)：103-105