三角葉黃連內生真菌產物紅色色素的穩定性研究

譚友莉，馬云桐，嚴鑄云，馬 慶

成都中醫藥大學藥學院四川省中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137

天然色素大多具有一定的營養與保健作用，所以在一些西方發達國家天然色素備受青睞，如玉米黃、高粱紅等已經普遍使用。課題組前期從三角葉黃連內生真菌中篩選獲得一株可產天然紅色色素的菌株，該菌株通過固體發酵、提取、分離后得到紅色色素。經初步研究證明其具有一定的開發與利用價值。但天然色素存在的顯著問題是穩定性差［1-3］，著色力不好［4］。而穩定性的好壞直接影響著色物質的色澤和品質［5］。為此本實驗開展對此紅色素穩定性的研究，為進一步開發利用該紅色素提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

來源于毛茛科植物三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsial)中分得的內生真菌，經顯微鑒定為半知菌類(Fungi Imperfecti)的無孢菌群(Mycelia Sterilia)［6］，并用該菌株采用固體發酵所得菌絲產物，經提取、分離后獲得的紅色色素作為實驗材料。

1.1.2 試劑

CaCl2、A1C13、ZnSO4、FeC13、MgC12、Na2SO4、K2SO4、H2O2、NaOH、Na2SO3;二氯甲烷、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、山梨酸鉀、葡萄糖、明膠、苯甲酸鈉、食鹽等均為分析純或食品級(以上化學試劑均購自成都科龍化工試劑廠);維生素A、維生素B、維生素D、維生素E(購自成都錦華藥業有限責任公司)。

1.1.3 儀器與設備

JA1003電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);MCD-B161F干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);HP8453紫外/可見分光光度計(美國惠普公司);HH-S24數顯恒溫水浴鍋(成都雅榮實驗儀器有限公司);KQ-5200E型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取適量紅色素樣品和石英砂按1∶5(m/m)的比例置研缽中研磨成粉末。將粉末置于圓底燒瓶中，加入10倍量的二氯甲烷溶液，搖勻后在40℃超聲1 h后取出離心，上清液即為紅色素提取液。

1.2.2 光譜掃描

取上述樣品溶液，置于HP8453紫外/可見分光光度計下，在200～800 nm范圍內進行光譜掃描，檢測最大吸收峰，測得結果為515 nm，將其作為測定波長。

1.2.3 溫度對紅色素穩定性的影響

分別取樣品溶液 10 mL，置于 40、50、60、70 ℃(沸騰溫度)水浴鍋中恒溫處理1～5 h，每隔1 h取出部分樣品，避光靜置0.5 h，測定其在515 nm處的吸光度值，并計算色素殘存率，并分析不同溫度條件對紅色素穩定性的影響。

1.2.4 光照對紅色素穩定性的影響

分別取樣品溶液10 mL，置于暗室、室內散射光、室外日光及紫外光下，每隔5 h測定其在最大吸收波長515 nm處的吸光度值并計算殘存率，分析不同光照條件對紅色素穩定性的影響。

1.2.5 金屬離子對紅色素穩定性的影響

分別取等量制備樣品，滴加0.01、0.05、0.1 mmol/L 的 CaCl2、A1C13、ZnSO4、FeC13、MgC12、Na2SO4、K2SO4后，并超聲30 min使其充分溶解，并與空白組對照，觀察紅色素溶液顏色變化，在室溫下靜置24 h后測定其在515 nm處的吸光度值，并計算色素殘存率。

1.2.6 氧化劑對紅色素穩定性的影響

將過氧化氫(H2O2)溶液分別配成濃度為0.5%、1.5%和3%的紅色素溶液，以不加H2O2為對照組(0%)。并于2、4、8 h測定其在515 nm處的吸光度值，計算色素殘存率并分析不同濃度下氧化劑對樣品紅色素穩定性的影響。

1.2.7 還原劑對紅色素穩定性的影響

將抗壞血酸和亞硫酸鈉(Na2SO3)分別配成濃度為0%、0.02%、0.06%和0.10%的紅色素溶液，置于暗室中放置，并于2、4、8 h測定其在515 nm處的吸光度值，計算色素殘存率并分析不同還原劑對樣品紅色素穩定性的影響。

1.2.8 酸度調節劑對紅色素穩定性的影響

將檸檬酸、氫氧化鈉、蘋果酸和檸檬酸鈉分別配成濃度均為2%的紅色素溶液，以純的紅色素提取液為對照。置于室內暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，計算色素殘存率并分析不同酸度調節劑對樣品紅色素穩定性的影響。

1.2.9 維生素對紅色素穩定性的影響

將VA、VB、VD和VE分別配成濃度均為0.1%的紅色素溶液，作定性考察，以純的紅色素提取液為對照。置于室內暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，分析不同維生素試劑對樣品紅色素穩定性的影響。

1.2.10 常用食品添加劑對紅色素穩定性的影響

分別將葡萄糖、氯化鈉、明膠和苯甲酸鈉配成濃度均為3%的紅色素溶液，作定性考察。另將苯甲酸鈉分別配成濃度為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的紅色素溶液，觀察不同濃度苯甲酸鈉對紅色素的影響，以純的紅色素提取液為對照。置于室內暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，分析不同食品添加劑對樣品紅色素穩定性的影響。

1.2.11 防腐劑山梨酸鉀對紅色素穩定性的影響

將山梨酸鉀分別配成濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的紅色素溶液，以純的紅色素提取液為對照，置于室內暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，計算色素殘存率并分析不同防腐劑對樣品紅色素穩定性的影響。

2 結果與分析

2.1 溫度對色素穩定性的影響

當溫度在40℃～70℃條件下的紅色素吸光值變化如圖1所示。由圖1可知該紅色色素在不同水浴溫度條件下的有效含量相差不大，并且隨著水浴時間的延長其含量依然穩定，吸光度無明顯變化，表明該紅色素的耐熱性較好。

圖3 紫外線對紅色素穩定性的影響Fig.3 Effect of Ultrariolet rays on the stability of the red pigment

2.2 光照對紅色素穩定性的影響

經測定在避光、室內散射光、室外直射光和紫外燈下樣品的吸光度值(OD515)結果:如圖2、3。

由圖2、3可知其吸光度值隨存放時間的延長幾乎無變化，表明三角葉黃連內生真菌的這種紅色素具有較強的光適應性。

2.3 金屬離子對紅色素穩定性的影響

經測定樣品在不同濃度的金屬離子的吸光度值(OD515)結果見表1。

表1 金屬離子對紅色素穩定性的影響Table 1 Effect of metal ions on the stability of the red pigments

由表1可知不同濃度的金屬離子Na+、Mg2+、A13+、Ca2+、K+對紅色素提取液具有一定增色作用，使天然紅色色素提取液的紅色加深;不同濃度梯度的Fe3+和Zn2+可使紅色色素溶液顏色變成深黃色，說明此紅色素提取物可能對Fe3+和Zn2+較敏感。由此可知，除Fe3+和Zn2+外的其他多種常見金屬離子在不同濃度下對紅色素影響較小。

2.4 氧化劑對紅色素穩定性的影響

經測定含不同濃度的雙氧水(H2O2)的樣品吸光度值(OD515)結果見圖4。

圖4 雙氧水對紅色素穩定性的影響Fig.4 Effect of hydrogen peroxide on the stability of the red pigment

由圖4中可知，在2 h內，不同濃度雙氧水處理處理，色素OD值變化不顯著;當時間增加至4 h，紅色素的OD值明顯降低;繼續延長時間至8 h，紅色素的OD值無明顯下降。因此，紅色素對氧化劑雙氧水在一定的時間范圍內呈時間依賴性，處理時間越長，殘留量越少。說明該色素對氧化劑的穩定性較差。

2.5 還原劑對紅色素穩定性的影響

經測定含不同濃度的亞硫酸鈉和抗壞血酸的樣品吸光度值(OD515)結果見圖5、6。

由圖5可知，隨著亞硫酸鈉(Na2SO3)的濃度和時間的增加，對紅色素有增益作用，對其穩定性影響不明顯，說明該色素對亞硫酸穩定性較好。由圖6可知，紅色素溶液中加維生素C后在處理2～4 h，其吸光度明顯下降，隨維生素C濃度的增加紅色素吸光度呈現下降趨勢。表明該色素不耐受還原劑抗壞血酸。由圖5、6可知，紅色色素對不同種類的還原劑的適應性不同。

圖5 亞硫酸鈉對紅色素穩定性的影響Fig.5 Effect of sodium sulfite on the stability of the red pigment

圖6 抗壞血酸對紅色素穩定性的影響Fig.6 Effect of ascorbic acid on the stability of the red pigment

2.6 酸度調節劑對紅色素穩定性的影響

經測定含2%的(檸檬酸鈉、蘋果酸和氫氧化鈉)樣品溶液吸光度值(OD515)結果見圖7。

圖7 酸度調節劑對紅色素穩定性的影響Fig.7 Effect of acidity regulator on the stability of the red pigment

加入檸檬酸鈉后，處理25 h，溶液顏色幾乎不變，吸光度值變化不明顯;加入氫氧化鈉處理5 h，其吸光度值顯著下降42.04%，25 h時變為吸光度值趨近于0，并出現紅色沉淀。加入檸檬酸處理5 h后，吸光度值顯著下降為初始值的12.8% ，延長至25 h時，吸光度值未繼續下降，溶液變成亮黃色;加入蘋果酸處理5 h，吸光度值顯著下降為初始值的11.23%，延長至25 h時，吸光度值未繼續下降，溶液變成亮黃色。由此表明，檸檬酸鈉能夠維持三角葉黃連內生菌的紅色天然色素的穩定性，而檸檬酸、蘋果酸和氫氧化鈉對紅色素有某種破壞或者螯合作用。

2.7 維生素對紅色素穩定性的影響

在紅色素提取液中加入濃度為0.1%的維生素后，其吸光度與色素溶液存放時間的關系曲線如圖7所示。

圖8 維生素對紅色素穩定性的影響Fig.8 Effect of vitamin on the stability of the red pigment

由圖8可以看出加入Va、Vb、Vd和Ve試劑后隨著時間的延長，紅色素溶液的吸光度值幾乎沒有變化，表明該紅色素具有多種維生素的耐受性。

2.8 常用食品添加劑對紅色素穩定性的影響

在紅色素提取液中加入濃度為3%的葡萄糖、明膠、氯化鈉和苯甲酸鈉等常用食品添加劑后，其吸光度與色素溶液存放時間的關系曲線如圖8、9所示。

圖9 常用食品添加劑對紅色素穩定性的影響Fig.9 Effect of common food additives on the stability of the red pigment

由圖9可知加入高濃度3%葡萄糖、氯化鈉和明膠后，隨時間的延長紅色素OD值基本沒有變化;加入3%的苯甲酸鈉，隨時間的延長，OD值顯著下降，處理5 h，紅色素OD值為0。

圖10 苯甲酸鈉對紅色素穩定性的影響Fig.10 Effect of sodium benzoate on the stability of the red pigment

由圖10顯示不同濃度的苯甲酸鈉對紅色素OD值的影響，低濃度(＜0.5%)苯甲酸鈉對此紅色素OD值基本沒有影響，隨著濃度的升高，吸光度值顯著下降，加入1.0%的苯甲酸鈉處理5 h，紅色素OD值為初始的35.82%，25 h后，紅色素OD值為初始的5.7%;1.5%的苯甲酸鈉混合溶液5h后紅色素OD值為初始的26.78%，處理15 h后吸光度值降為0;2.0%苯甲酸鈉的混合溶液在5 h后最大吸光值即降為0，表明大于0.5%的苯甲酸鈉對此紅色素OD值影響顯著。

2.9 防腐劑山梨酸鉀對紅色素穩定性的影響

為檢測防腐劑對三角葉黃連內生菌的紅色色素穩定性影響，測定了含不同濃度山梨酸鉀的色素提取液的吸光度值，如圖11所示。

圖11 山梨酸鉀對紅色素穩定性的影響Fig.11 Effect of potassium sorbate on the stability of the red pigment

由圖11可知，色素液中加入不同濃度的山梨酸鉀以后，當濃度小于0.05%時，吸光度幾乎不變;在0.1% ～0.2%范圍內，吸光度值略有下降，在25 h以后紅色素殘存率維持在95%左右，說明此紅色素對山梨酸鉀有較好的穩定性。

3 結論

本文使用分光光度法，檢測了三角葉黃連的內生菌發酵物中提取色素對多種日常生活成分的適應性，發現其對這些物質的耐受程度存在較大差異，此結果有利于合理地開發、貯存這種新型的天然色素，為后續的深入研究奠定基礎。此紅色素在70℃下，具有較好的穩定性，在加工、使用過程中，可一定程度上避免高溫加熱，保護其色澤。溫度、光照、維生素以及常用食品添加劑等對紅色素影響很小。此紅色素溶液在Fe3+和Zn2+的影響下變成黃色，有可能是紅色素和Fe3+和Zn2+絡合生成其它物質，也可能由于直接和紅色素反應引起色變;此紅色素對金屬離子Fe3+和Zn2+敏感，在生產、加工和儲存過程中應避免與鐵器、鋁器接觸。氧化劑和還原劑抗壞血酸對此紅色素穩定性影響明顯，避免混用;酸度調節劑中檸檬酸，蘋果酸和氫氧化鈉對紅色素溶液穩定性影響大，該紅色素適合在中性或弱酸性條件下使用。此紅色素對苯甲酸鈉很敏感，苯甲酸鈉濃度不同時，對紅色素的影響差異很大，在使用時要特別注意。該紅色色素由多種成分混合而成，需進一步經過成分分離，結構鑒定來研究證明，另一方面可以進一步優化其生產和提取工藝，篩選出保護色澤的最佳條件，以確保該色素能應用于生產生活中，提高其應用價值。

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