天門冬多糖對環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的免疫調節作用

佟春玉，孫越春，秦學功，葛文忠，崔玉東

黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319

天門冬，百合科植物。又名天冬。性寒，味甘，微苦。作為一種傳統的中藥，具有養陰清熱，潤肺滋腎的功效。用于治陰虛發熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、消渴、便秘等病癥［1］。多糖作為一種免疫調節和促進劑，對巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)和淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)的功能都有調節作用。天門冬多糖(Asparagus cochinchinensis polysaccharide，ASP)是從中藥天門冬中提取的生物活性成分，據報道具有清除自由基及抗脂質過氧化活性。近年來，研究人員發現ASP可以刺激豬和小鼠的體外T、B淋巴細胞增殖，但其在體內的實驗卻未見報道［2，3］。因此，本研究采用環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠模型，研究ASP對免疫抑制小鼠的保護作用，為未來ASP的臨床應用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康Balb/c小鼠，SPF級，雄性，6～8周齡，體重(20±2)g，購于吉林大學基礎醫學院實驗動物中心，合格證號:SCXK(吉2003-0001)。

1.2 實驗試劑

ASP購自西安斯諾特生物技術有限公司，刀豆蛋白A(Con A IV型)、脂多糖(LPS)、環磷酰胺(CTX)均為Sigma產品;細胞因子試劑盒購于美國Biolegend公司，RPMI-1640完全培養基(含100 IU/mL青霉素、100 g/L鏈霉素、1%谷氨酰胺和10%滅活新生胎牛血清，pH 7.2)為Gibco產品;胎牛血清、DMSO、生理鹽水均是國產產品。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥

小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，對照組(生理鹽水)，模型組，天門冬多糖高、中、低劑量組，連續給藥7 d，給藥第3 d，除對照組外，其他各組小鼠均腹腔注射CTX 50 mg/kg，連續3 d，建立免疫抑制小鼠模型。

1.3.2 臟器指數測定

7d后，稱重，頸椎脫臼處死小鼠，分離胸腺和脾臟稱濕重，以小鼠胸腺或脾臟重/體重(mg/g)作為胸腺指數或脾臟指數。

1.3.3 免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖反應測定

無菌條件下制備Balb/c小鼠脾細胞懸液加入到96孔板中，每孔100 μL，調整脾細胞濃度為5×106個細胞/mL，此后，加入 Con A(終濃度 5 μg/mL)或 LPS(終濃度 20 μg/mL)100 μL，使終體積為200 μL并各設三個復孔。96孔板置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養44 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)再繼續培養4 h。4 h后移除培養液，每孔加入150 μL DMSO震搖10 min，在570 nm測量吸光值。

1.3.4 免疫抑制小鼠血清細胞因子含量的檢測

小鼠第7 d給藥后摘除眼球取血并分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法測定血清IL-2和IL-4含量，參考試劑盒使用說明書步驟操作，于450 nm波長處檢測吸光度，根據濃度標準曲線計算IL-2和IL-4含量。

1.3.5 統計分析

所有數據均用SPSS 13.0統計軟件包進行處理，數據以均數±標準差(Mean±SD)表示，資料進行正態性檢驗;多組計量資料采用one-way ANOVA，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法。P＜0.05有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 ASP對免疫抑制小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響

ASP對脾臟指數的影響如表1所示，與空白組相比，CTX組的胸腺指數和脾臟指數顯著降低，而ASP各劑量組的胸腺指數脾臟指數明顯升高(P＜0.01)，說明ASP在一定的劑量范圍內可以緩解CTX對小鼠的免疫抑制作用。

表1 ASP對CTX引起的免疫低下小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響(±s)Table 1 Effects of ASP on thymus and spleen index in immunosuppressed mice(±s)

表1 ASP對CTX引起的免疫低下小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響(±s)Table 1 Effects of ASP on thymus and spleen index in immunosuppressed mice(±s)

注:與對照組相比，##P＜0.01;與CTX組相比，＊＊P＜0.01。Note:##P＜0.01vs.Control group;＊＊P＜0.01 vs.CTX group.

組別Group濃度Concentration(mg/kg)胸腺指數Thymus index(mg/g)脾臟指數Spleen index(mg/g)空白組Control Group - 2.57±0.09 5.19±0.06 CTX組CTX Group CTX(50) 1.35±0.07## 3.08±0.19##實驗組 Experimental Group 10+CTX(50) 1.73±0.11＊＊ 4.20±0.18＊＊20+CTX(50) 2.16±0.09＊＊ 4.53±0.10＊＊40+CTX(50) 2.53±0.08＊＊ 4.84±0.12＊＊

2.2 ASP對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

圖1 ASP對脾淋巴細胞體內增殖的影響Fig.1 Effect of ASP on splenocyte proliferation in vivo

ASP對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響如圖1所示。ConA或LPS刺激脾淋巴細胞會引起細胞增殖，而50 mg/kg的CTX能有效地抑制ConA或LPS刺激脾淋巴細胞增殖反應(P＜0.01)。與此相反，ASP加上CTX可以有效地緩解CTX對脾細胞增殖反應的抑制作用，并呈劑量依賴的方式。

2.3 ASP對免疫抑制小鼠血清細胞因子IL-2和IL-4的影響

ASP對免疫抑制小鼠血清中主要細胞因子水平的影響如圖2所示，我們使用ELISA方法檢測小鼠血清中的IL-2和IL-4的細胞因子水平。從圖中可以看出，CTX組血清中的細胞因子IL-2和IL-4比對照組顯著降低(P＜0.01);與CTX組相比，當ASP組劑量為20 mg/kg或40 mg/kg時，免疫抑制小鼠血清中的IL-2和IL-4的水平都顯著提高(P＜0.01)。

圖2 ASP對免疫抑制小鼠血清中IL-2和IL-4分泌水平的影響Fig.2 Effect of ASP on serum IL-2 and IL-4 of immunosuppressed mice

3 討論

環磷酰胺為氮芥與磷酰胺基結合而成的化合物，是臨床常用的烷化劑類免疫抑制劑?？捎糜谥委煾鞣N自身免疫性疾病，即能抑制細胞增殖，非特異性殺傷抗原敏感性小淋巴細胞，限制其轉化為免疫母細胞［4］。本文采用CTX所致免疫低下小鼠模型，研究ASP對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，探討ASP的免疫藥理效應，摸索其最佳劑量范圍。

眾所周知，細胞有絲分裂原ConA可以刺激T淋巴細胞增殖，LPS可以刺激B淋巴細胞增殖，T淋巴細胞主要參與機體的細胞免疫反應，B淋巴細胞主要參與體液免疫反應［5-7］。在體內細胞增殖實驗中，采用MTT法測定ASP對LPS和ConA誘導的淋巴細胞增殖的影響。結果顯示ASP可以緩解CTX組對小鼠脾細胞體內增殖反應的抑制作用，因此說明ASP通過細胞免疫和體液免疫兩種方式參與機體免疫反應，并呈現一定的劑量依賴模式。

細胞因子能介導和調節免疫應答，檢測細胞因子分泌水平可以密切反映機體的免疫狀態。IL-2主要由TH1細胞分泌，參與細胞免疫反應;IL-4主要由TH2細胞分泌，參與體液免疫反應［8-10］。本研究中，在CTX誘導小鼠免疫功能抑制的基礎上，給予ASP，可顯著增加小鼠血清中IL-2、IL-4含量。表明ASP對CTX誘導的免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定的免疫調節作用，能提高小鼠的免疫防御功能。

綜上可見，ASP可以消除CTX誘導的小鼠免疫抑制作用，對臨床具有一定的應用價值，未來需對ASP免疫增強機制進一步研究，為其臨床應用提供科學依據。

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2 Pan GZ(潘貴珍)，Hu TJ(胡庭俊)，Su ZJ(蘇子杰)，et al．Effect of Asparagus cochinchinensis polysaccharide on proliferation of swine splenic lymphocytes in vitro.J Feed Ind(飼料工業)，2012，33:35-37.

3 Kang L(康樂)，Yao DB(姚東璧)，Hu TJ(胡庭俊)，et al．The effect of Asparagus cochinchinensis polysaccharide on proliferation of splenic lymphocytes from mice in vitro.Chin J Anim Hus Vet Med(中國畜牧獸醫)，2010，37:15-17.

4 Huang XH，Hu YH，Zhao X，et al.Sulfated modi?cation can enhance the adjuvant activity of Astragalus polysaccharide for ND vaccine.Carbohyd Polym，2009，73:303-308.

5 Li R，Chen WC，Wang WP，et al.Extraction，characterization of Astragalus polysaccharides and its immune modulating activities in rats with gastric cancer.Carbohyd Polym，2009，78:738-742.

6 Lu J，Guan S，Shen X，et al.Immunosuppressive activity of 8-gingerol on immune responses in mice.Molecules，2011，16:2636-2645.

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