3 種根皮素酰腙衍生物的合成及抑制酪氨酸酶和抗氧化活性

杜 鵬，余燕影* ，曹樹穩，2

1南昌大學化學系，南昌330031;2 食品科學與技術國家重點實驗室 南昌大學，南昌330047

酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)廣泛存在于動植物體，在動植物體內酶促褐變、體內色素合成的過程中起了關鍵的作用。它具有單酚酶的活性能將酪氨酸羥化，產生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-多巴)，也具有二酚酶的活性，能將L-多巴氧化成多巴醌，進而生成黑色素［1］。酪氨酸酶抑制劑就是通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，近年來，國內外學者對酪氨酸酶抑制劑的研究非?；钴S。根皮素(Phloretin)為具有二氫查爾酮類結構的黃酮類化合物，是近年來國外研究較多的一種具有生物活性的天然化合物，主要分布于蘋果、梨等多汁水果的果皮及根皮。具有抗氧化［2］，抗突變，抗炎及抗腫瘤等生理功效，同時又有美白，抗皺等美容功效，能抑制酪氨酸酶和黑色素細胞活性［3］，對各種皮膚色斑有淡化作用，是一種較有開發前景的新型皮膚美白劑，因此它在美容行業也受到越來越多的關注。目前國內外對其進行化學修飾的報道并不多見。

酰腙類化合物屬于席夫堿的一種，不僅具有獨特的化學結構，而且在抗菌，抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面有著獨特的生物和藥理活性。本文以根皮素為母體，與三種酰肼化合物結合，引入活性基團，合成了三種新型的酰腙類化合物，提高根皮素的生物活性，以期獲得高效、安全的酪氨酸酶抑制劑，開拓其應用領域。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

UV-2450 紫外分光光度計(日本島津公司);FTIR Nicolet5700 傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱電尼高力公司);AV-600 型核磁共振儀(德國BRUKER 公司);ZQ4000/2695 型液質聯用儀(美國Waters 公司);X-4 顯微熔點測定儀(溫度計未校正);DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;DZF-150數顯小型恒溫真空干燥箱;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

根皮素(98%，陜西華泰精細化工);苯甲酰肼(99%)、水合肼(85%)、水楊酸甲酯(98%)、對羥基苯甲酸乙酯(99%)、對甲苯磺酸(99%)均購買于國藥化學試劑廠;酪氨酸酶(1881 U/mg，Sigma 公司);DPPH(Sigma 公司);硅膠(200～300 目，青島海浪硅膠干燥劑廠);其余試劑均為國產分析純，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 根皮素酰腙衍生物1～3 的合成

2-羥基苯甲酰肼和4-羥基苯甲酰肼的合成分別按照文獻［4，5］的方法合成。2-羥基苯甲酰肼的合成方法為:將7.60 g 水楊酸甲酯(0.05 mol)和20 mL 85%水合肼溶入無水乙醇中，80.0 ℃加熱回流10 h，蒸出大部分乙醇，冷卻、攪拌，有白色沉淀生成，抽濾。乙醇重結晶，抽濾、干燥得白色針狀晶體。產率95%，熔點m.p.148.0～149.0 ℃;4-羥基苯甲酰肼的合成方法如下:稱取9. 97 g 4-羥基苯甲酸乙酯(0.06 mol)，加入25 mL 85%水合肼，80.0 ℃加熱回流15 min，再加入20 mL 乙醇，繼續加熱回流4 h，蒸出部分乙醇，冷卻，抽濾得白色沉淀。乙醇重結晶，抽濾、干燥得到白色粉末。產率為90%，熔點m.p.258.0～260.0 ℃。

化合物1～3 的合成方法參考文獻［6］。分別稱取15 mmol 根皮素(4.1139 g)及15 mmol 酰肼置于250 mL 三頸瓶中，加入70 mL 無水乙醇攪拌溶解后，加入30 mL 甲苯和0.3 g 對甲苯磺酸，在88.0℃回流分水反應48 h。用200～300 目硅膠柱層析，TLC 跟蹤檢測，所用洗脫劑分別為:乙酸乙酯/石油醚=2∶1(化合物1);氯仿/甲醇=8∶1(化合物2);乙酸乙酯/石油醚=1∶1(化合物3)。將洗脫液收集、濃縮、真空干燥至恒重，分別得到目標產物。

圖1 根皮素酰腙衍生物1～3 的合成路線Fig.1 Synthesis routes for compounds 1-3

1.2.2 抑制酪氨酸酶活性研究

酪氨酸酶活力的測定是基于L-DOPA 的酶催化氧化產物—多巴色素在475 nm 處有最大吸收，吸光系數ε=3700 (cm· mol/ L)-1。酪氨酸酶活力單位(U/ min)規定:以每分鐘多巴色素在475 nm 處的吸光度(A475)增加0.001 為一個酶活力單位。所以，通過測定酶催化反應體系的A475隨時間的增長直線，從直線斜率即可求得酶活力。

參照文獻［7］的方法略作修改:在3 mL 的反應體系中，將0.3 mL 的5.0 mmol/L L-DOPA 溶液(溶劑為pH =6. 8 的磷酸鹽緩沖液)加入0. 6 mL 的0.25 mol/L 的PBS 緩沖溶液和1.9 mL 的蒸餾水，在30 ℃恒溫水浴中恒溫10 min，加入0.1 mL 的不同濃度樣品溶液(DMSO 溶劑)和0.1 mL 酪氨酸酶水溶液(160 μg)，測定OD475。此測活體系中酶的終質量濃度為5.3 μg/mL。

待測樣品對酪氨酸酶的抑制率按下式計算:

抑制率( %) =(1 -OD1/OD2) ×100%

式中:OD1是指含有底物、酪氨酸酶、待測樣品的測活體系的酶活力值;OD2是指含有底物、酪氨酸酶，但不含樣品的測活體系的酶活力值。

1.2.3 清除DPPH 自由基研究

參照Lee YL 等［8］方法略作修改:比色管中依次加入不同濃度受試樣品1 mL 及0.6 mmol/L DPPH甲醇溶液0.5 mL，然后以甲醇補充體積至5 mL，30 min 室溫避光反應后于517 nm 處測定吸光值。平行測定三次，結果為平均值±標準偏差。

其中:A1為不加樣品，加入DPPH 時的吸光度值;A2為加入樣品和DPPH 時的吸光度值。

1.2.4 總抗氧化能力( ABTS 自由基)

參照Re，R［9］的方法略作修改。ABTS 自由基的生成方法:將7 mmol/L 的ABTS 水溶液與2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液混合，在室溫暗處放置12～16 h 后使用。使用前將ABTS 自由基儲備液用乙醇稀釋至吸光度值為0.70 ±0.02(734 nm 處)。比色管中依次加入系列濃度的受試樣品0.5 mL 以及ABTS·+工作液5 mL，以乙醇溶液作為空白對照，室溫避光反應6 min 后于734 nm 處測定吸光值。平行測定三次，結果為平均值±標準偏差。

其中，A1為不加樣品，加入ABTS·+時的吸光度值;A2為加入樣品和ABTS·+時的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.1 UV 光譜

將根皮素及其酰腙分別溶于無水乙醇，配成濃度為1 ×10-5mol/L 的溶液，測定紫外-可見吸收光譜，測定波長為200～600 nm，結果見圖2:

圖2 化合物的紫外-可見光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of phloretin and its hydrazone 1-3

由圖可知，根皮素在225、286 nm 處有兩個強吸收峰，酰腙與母體相比，峰Ⅰ由286 nm 紅移至310 nm(1)、312.5 nm(2)、314 nm(3)，強度略增。是由于形成酰腙后，次氨基氮原子的孤對電子與羰基和亞氨基雙鍵形成了p-π 共軛體系，使得根皮素母體的共軛體系延長，導致吸收波長向長波方向移動。

2.1.2 IR 光譜

用KBr 壓片，測定根皮素及其酰腙衍生物1～3的紅外特征吸收峰，測量范圍400～4000 cm-1，數據見表1:

表1 化合物的主要紅外吸收頻率及歸屬(cm-1)Table 1 IR spectra data of phloretin and its hydrazone 1-3

根皮素的羰基振動頻率ν (C =O)在1633 cm-1處出現較弱特征吸收峰，形成酰腙后，化合物1～3分別在1631、1627、1638 cm-1處出現C=N 很強的特征吸收峰，3296、3254、3363 cm-1處出現了NH 伸縮振動特征峰，分別在1592、1587、1609 cm-1處出現NNH 彎曲振動特征峰，這均說明合成了酰腙。

2.1.31H NMR 及13C NMR 譜學及質譜數據

Phloretin benzoyl hydrazone(化合物1)Yield:39%;mp. :258～260 ℃;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:2.76(2H，t，J =7.8 Hz，β-H)，3.19(2H，t，J =7.8 Hz，α-H)，5.76 (2H，s，3'，5'-H)，6.66 (2H，dd，J =2.4，2.4 Hz，3，5-H)，7.01(2H，m，2，6-H)，7.53(2H，dd，J =7.2，1.2 Hz，3''，5''-H)，7.60(1H，d，J=0.6 Hz，4''-OH)，7.92(2H，dd，J=1.2，0.6 Hz，2''，6''-H)，8.73 (1H，d，J =2.4 Hz，N-NH)，9.13 (1H，s，4-OH)，10.45(1H，d，J =0.6Hz，4'-OH)，12.24(2H，s，2'，6'-OH);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:203.6 (-C=O)，166.7 (-C=N)，166.3 (C-2')，164.4 (C-6')，156.5 (C-4')，155.8 (C-4)，133.0 (C-1)，132.4 (C-2'')，132.2(C-6'')，129.6 (C-1'')，129.0 (C-3'')，129.0 (C-5'')，127.9 (C-4'')，127.8 (C-1')，115.5 (C-2，6)，103.2 (C-3，5)，90.4(C-3'，5')，45.7 (C-β)，30.1(C-α);ESI-MS:m/z calcd for C22H20O5N2［M +Na+］415.39，found［M+Na+］415.06。

Phloretin 2-hydroxy benzoyl hydrazone(化合物2) Yield:41%;mp. :254～256 ℃;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:2.76 (2H，t，J=7.8 Hz，β-H)，3.19 (2H，t，J=7.8 Hz，α-H)，5.77 (2H，s，3'，5'-H)，6.65 (2H，dd，J=1.8，2.4 Hz，3，5-H)，6.96(2H，m，3''，6''-H)，7.01 (2H，t，J =2.4 Hz，2，6-H)，7.45 (1H，t，J = 6.6，1.8 Hz，5''-H)，7.88(1H，m，J =1.8，1.2 Hz，4''-H)，8.78 (1H，s，NNH)，9.12 (1 H，s，4-OH)，10.52 (1H，s，4'-OH)，11.84 (1H，s，2''-H)，12.24 (2H，s，2'，6'-OH);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:203.7 (-C = O)，169.0 (-C = N)，164.4 (C-2'')，159.7 (C-2'，6')，156.1 (C-4'')，155.8 (C-4)，134.6 (C-1)，132.2(C-1'')，129.6 (C-4'')，128.6 (C-6'')，119.5 (C-5'')，117.8 (C-3'')，115.5 (C-1')，115.3 (C-2，6)，103.3 (C-3，5)，90.5 (C-3'，5')，45.8 (C-β)，30.1(C-α);ESI-MS:m/z calcd for C22H20O6N2［M-H+］407.40，found［M-H+］406.89。Phloretin 4-hydroxy benzoyl hydrazone(化合物3) Yield:45%;mp. :277～279 ℃;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:2.75 (2H，t，J =7.8Hz，β-H)，3.17 (2H，t，J=7.8 Hz，α-H)，5.73 (2H，s，3'，5'-H)，6.65 (2H，d，J=2.4 Hz，3，5-H)，6.65 (2H，d，J=8.4 Hz，3''，5''-H)，7.01 (2H，d，J=8.4 Hz，2，6-H)，7.79 (2H，t，J =9.0 Hz，2''，6''-H)，8.65(1H，s，N-NH)，9.14 (1H，s，4-OH)，10.13 (1H，s，4'-OH)，10.20 (1H，s，4''-OH)，12.24(2H，s，2'，6'-OH);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:203.5 (-C=O)，166.3 (-C=N)，164.2 (C-4'')，161.2 (C-2'，6')，156.7 (C-4')，155.8 (C-4)，132.2 (C-1，1')，129.8 (C-1')，129.5 (C-2'，6')，123.6 (C-3''，5'')，115.5 (C-2，6)，103.2 (C-3，5)，90.4 (C-3'，5')，45.6 (C-β)，30.1(C-α);ESI-MS:m/z calcd for C22H20O6N2［M-H+］407.40，found［M-H+］406.51。

2.2 活性研究

2.2.1 化合物對酪氨酸酶活力的影響

圖3 抑制酪氨酸酶活力IC50Fig.3 Inhibitory IC50 for Phloretin，hydrazone 1-3 against tyrosinase

由圖3 可知，化合物抑制酪氨酸酶活力大小的順序是:化合物2 ＞曲酸＞化合物3 ＞化合物1 ＞根皮素。與根皮素相比較，根皮素苯甲?；?1)雖表現出較強的抑制能力，但兩者之間沒有顯著性差異(P ＞0.05);根皮素2-羥基苯甲?；?2)和根皮素4-羥基苯甲?；?3)的抑制酶活力能力得到明顯提高，呈現顯著性差異(P ＜0.05)，且酰腙2(芳?；江h鄰位有一個羥基)的抑制能力比酰腙3(芳?；江h對位有一個羥基)強，甚至強于常用美白劑曲酸，這可能是因為?；江h上羥基的位置不同所產生的影響［10］。

2.2.2 清除DPPH 自由基

圖4 清除DPPH 自由基能力Fig.4 Scavenging activity of samples on DPPH radicals

由圖4 可知，化合物清除DPPH 自由基的能力順序是:2 ＞3 ＞1 ＞BHA ＞BHT ＞根皮素。新合成的三種化合物的清除DPPH 自由基的能力相比根皮素都有了顯著提高，并且強于常用抗氧化劑BHA 和BHT。酰腙2 和3 的IC50明顯小于酰腙1 和根皮素，說明在芳?；胍粋€羥基后的酰腙化合物具有更好的自由基清除能力。酰腙2 清除自由基能力強于3，這也證明芳?；江h上羥基的個數和位置在化合物清除DPPH 自由基能力中有著關鍵作用。

2.2.3 總抗氧化能力

圖5 清除ABTS 自由基能力Fig.5 Scavenging activity of samples on ABTS radicals

由圖5 中的IC50值可知，各受試樣品均具有較強的清除ABTS 自由基能力，根皮素和酰腙1～3 的清除ABTS 自由基的能力都強于常用抗氧化劑BHA和BHT，酰腙2 和3 的清除能力顯著高于母體根皮素和1，而根皮素和酰腙1 的清除能力相當(P ＞0.05)，酰腙2 (IC50= 1.60 ± 0.053 μM)的清除ABTS 自由基能力最強。此實驗結果證明芳?；江h上羥基的個數和位置在化合物清除ABTS 自由基能力中發揮著重要作用。

3 結論

以天然活性物質作為先導化合物，對其進行結構修飾和改造，是天然產物研究熱點之一。本文中以根皮素為母體合成了三種酰腙類化合物，并對其結構進行了表征。抑制酪氨酸酶活性和清除自由基實驗表明，酰腙2 和3 的抑制酪氨酸酶能力相比母體根皮素有了明顯提高;酰腙1～3 清除DPPH 自由基的能力得到明顯提高且均大于陽性對照品BHA、BHT;新合成酰腙2 和3 清除ABTS 自由基的能力也有了明顯增強。對物質構效關系探討表明，化合物芳?；江h上羥基的個數和位置在抑制酪氨酸酶和清除自由基能力中發揮著關鍵作用。

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