鲆鰈類主要病原菌抗血清的制備及應用

甘玲玲，王蔚芳，高淳仁，雷霽霖

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東青島266071；2.四川省富順縣水產漁政局，四川富順643200）

1 前言

隨著鲆鰈類養殖業的迅猛發展，疾病問題日顯突出，其中細菌性疾病占到鲆鰈類病害發生率的50%以上，包括各種弧菌，如鰻弧菌(Vibrio anguillarum)[1，2]、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)[3]、哈維弧菌(Vibrio harveyi)[4]、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)[5]；引起癤瘡病的殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)[6]、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)[7]等；引起腹水病的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[8]、遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)[9]等。

抗血清是指動物經抗原物質刺激后所產生的含有相應抗體的血清，包括抗毒素、抗細菌、抗病毒血清[10]?？寡逶谘芯恐锌捎米鳂藴赎栃匝?，在臨床應用中則可作為一種良好的治療性抗體。如傷寒菌的抗血清可用于傷寒病的診斷，甲胎蛋白的抗血清可診斷原發性肝癌，抗豬瘟血清能有效地控制豬瘟的疫情，羊抗犬瘟熱異源單血清對犬瘟熱有獨特的療效[10～12]。相對于人、畜牧類的抗血清研究，魚類的抗血清研究應用幾乎未見報道。本文用8種鲆鰈類常見病原菌制備滅活疫苗免疫大菱鲆獲得抗血清，采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定各抗血清的效價，并對8種病原菌、遲緩愛德華菌蛋白與各菌抗血清之間的免疫交叉反應進行分析，基于此結果初步判斷所得抗血清的質量，為進一步探索鲆鰈類細菌性疾病的預防、診斷及治療奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 試驗魚及飼養條件

試驗用健康大菱鲆購自青島通用水產有限公司，體重500 g，水溫15℃，暫養一周后發現無任何異常情況即開始進行試驗，免疫接種前后按常規養殖程序管理。

2.2 菌株來源及接種培養

試驗用菌株來自中國海洋大學生命學院，共8株，分別為鰻弧菌、創傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、鮰愛德華菌和遲緩愛德華菌。取弧菌接種于2216E平板28℃培養24 h，鮰愛德華菌接種于腦心浸液培養基(BHI)中20℃恒溫振蕩培養48 h，其他非弧菌接種于Luria-Bertani（LB）平板28℃培養24 h。然后將弧菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯28℃恒溫振蕩培養12 h，鮰愛德華菌接種于BHI液體培養基中20℃恒溫振蕩培養24 h，其他非弧菌接種于LB液體培養基中28℃恒溫振蕩培養12 h(遲緩24 h)。

2.3 滅活疫苗的制備

將培養的細菌倒入離心管中，4 000 r/m in，20min后，棄上清，收集菌體。用0.85%無菌生理鹽水重懸菌體，按表1進行細菌滅活[13～20]。用無菌生理鹽水洗脫甲醛，4 ℃，4 000 r/m in，20m in，反復兩次，后重懸于無菌生理鹽水，并調整濃度為109cfu/m L，以平板培養法檢測滅活效果。將弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑分別與滅活各菌液等體積混勻，使用超聲波破碎儀進行乳化。制備好的疫苗4℃保存備用。

表1 菌滅活條件Table1 The conditions of bacterial inactivation

2.4 大菱鲆的免疫與采血

試驗用魚隨機分為9組，每種疫苗接種三尾，對照組注射等量無菌生理鹽水，免疫程序見表2。分別于免疫前及免疫后第2周、第4周、第6周、第8周、第10周、第12周對免疫魚進行尾靜脈采血，分離血清，分裝后-20℃保存備用。

表2 免疫程序Table2 The immunization schedule

2.5 菌蛋白來源

試驗用遲緩愛德華菌蛋白來自華東理工大學，是一種遲緩愛德華菌免疫保護性抗原，為遲緩愛德華菌鞭毛相關蛋白，專利號：201110095826.7[21]。

2.6 ELISA

1）包被：用磷酸緩沖液將各滅活菌液(107cfu/m L)及遲緩愛德華菌蛋白(2μg/m L)包被于酶標板，每孔50μL，置4℃過夜。

2）封閉：磷酸鹽-吐溫溶液洗滌，將酶標板扣干，加入5%脫脂牛奶，每孔200μL，37℃恒溫封閉1 h。

3）與抗血清的反應：同上洗滌后，加入從1:100開始二倍系列稀釋(磷酸鹽作稀釋液)的各抗血清，每孔50μL，37℃恒溫孵育30m in。

4）與單抗及酶標二抗的反應：同樣洗滌后，加入用5%脫脂牛奶稀釋的鼠抗大菱鲆免疫球蛋白單克隆抗體腹水(本實驗室制備并保存)1:25 000稀釋液，每孔50μL，37℃恒溫孵育30m in；同上洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠抗體(5%脫脂牛奶1:2 000稀釋，50μL)，37℃恒溫孵育30m in。

5）顯色及終止：洗滌后每孔加入可溶性單組分四甲基聯苯胺底物溶液50μL并顯色10min，然后每孔加終止液(2M H2SO4)50μL，最后用酶標儀測定450 nm處的optical density(OD)值(5m in內讀數，P/N≥2.1時判定為陽性，其中P為實驗孔讀值，N為對照孔讀值)。

3 結果

3.1 遲緩愛德華菌抗血清效價變化

遲緩愛德華菌滅活疫苗免疫大菱鲆后第4周開始產生特異性抗體，抗體效價為1:3 200；之后抗體水平逐步升高；第10周抗體水平升高到1:102 400，并維持這一水平至第12周(見表3)。

表3 間接ELISA法測定遲緩愛德華菌滅活疫苗免疫大菱鲆后血清抗體效價的變化Table3 Antibody titer of turbot serum vaccinated with Edward siella tarda by indirect ELISA

3.2 各病原菌抗血清效價

免疫后第10周各病原菌抗血清效價見表4。

表4 8種病原菌抗血清效價Table4 The titer of anti-serum against eight bacterium

3.3 病原菌及菌蛋白與各抗血清的免疫交叉反應

3.3.1 病原菌

運用ELISA法，對8種病原菌與8種病原菌抗血清的免疫交叉反應進行了分析。由圖1可以看出，各病原菌抗血清與其對應的病原菌反應最強烈；鰻弧菌抗血清與鮰愛德華菌反應較強，與創傷弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌反應較弱；創傷弧菌抗血清與其他7種菌的反應相對較強；哈維弧菌抗血清與其他菌反應都比較弱；溶藻弧菌抗血清與創傷弧菌、豚鼠氣單胞菌的反應相對較強，與鰻弧菌、哈維弧菌、嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌、遲緩愛德華菌的反應較弱；豚鼠氣單胞菌抗血清與鰻弧菌、遲緩愛德華菌的反應較強，與創傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌的反應較弱；嗜水氣單胞菌抗血清與其他7種菌的反應較弱；鮰愛德華菌與其他7種菌的反應較強；遲緩愛德華菌抗血清與其他7種菌的反應較弱。

圖1 ELISA檢測8種病原菌抗血清與8種病原菌的交叉反應Fig.1 The sesult of eight anti-serum react with eight bacterium

3.2.2 遲緩愛德華菌蛋白

運用ELISA法，檢測遲緩愛德華菌蛋白與各細菌抗血清的免疫交叉反應，結果顯示，僅遲緩愛德華菌抗血清的效價高，并且效價水平與用遲緩愛德華菌檢測結果一致，而其他7種菌的抗血清效價均下降(見圖 2)。

圖2 ELISA法檢測8種病原菌抗血清與遲緩愛德華菌蛋白的免疫反應Fig.2 The result of Edward siella tarda protein reactwith eight kinds of anti-serum

4 結語

本試驗利用福爾馬林滅活病原菌制備滅活疫苗，肌肉注射大菱鲆獲得抗血清，并運用ELISA方法檢測各菌抗血清的效價在1:6 400～1:102 400。本研究表明，各菌抗血清具有較高效價，但其效價不同可能是由于大菱鲆對各菌的敏感性不同或抗血清中含有的雜蛋白質等因素造成的，也與各種病原菌本身構成的復雜性相關。

運用ELISA檢測方法對8種病原菌與抗血清進行了免疫反應分析，發現8種菌與各自對應的抗血清間的免疫反應最為強烈，但與其他細菌的抗血清亦有微弱的交叉反應；而在應用遲緩愛德華菌菌蛋白與各抗血清的免疫反應進行分析時，發現僅遲緩愛德華菌的抗血清效價高，其他菌的抗血清效價均大幅下降。本結果表明，各菌抗血清具有特異性，可用于鲆鰈類病原菌及遲緩愛德華菌蛋白的檢測，但各病原菌與其他病原菌抗血清之間不同程度的交叉反應為抗血清的應用帶來一定的影響。

特異性抗血清在臨床應用中可用作治療性抗體，廣泛應用于疫病流行早期對未感染動物的短期預防及疫病的早期治療；在研究中還可用作標準陽性血清用于微生物鑒定及疾病診斷。但是，抗血清的研究和應用中存在以下問題需要解決。

1）抗血清的安全性。新制備的抗血清必須保證沒有外源病原，而抗血清中的外源病原如何清除是一個難題。一般情況下，抗血清中的外源病原主要是病毒，清除病毒一般需要進行病毒排除、病毒去除及病毒滅活三個方面的程序，而有效的病毒處理技術還需進一步發展。

2）抗血清的效價。影響抗血清效價的因素主要包括抗原、動物的選擇、免疫劑量、次數、間隔時間、血清處理以及保存血清的溫度、期限等。因此如何獲得高效價特異性抗血清以及如何避免抗血清效價降低是以后的一個研究方向。

鲆鰈類雖然在我國養殖時間較短，但已成為我國海水養殖魚類的重要組成部分。鲆鰈類養殖以高密度的工廠化養殖模式為主，其疾病問題日益加劇，相關研究也越來越多。本試驗制備了鲆鰈類常見病原菌的抗血清并將其應用于檢測病原菌及菌蛋白。但抗血清存在著安全性、效價降低、質量等問題，對其研究及應用帶來了困擾，目前，還沒有有效的方法解決這些問題。在今后的研究中可在如何清除抗血清中外源病原、血清處理及保存方法、提高抗血清質量等方面進行深入研究。

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