牙鲆連續三代減數分裂雌核發育家系的遺傳特征分析

侯吉倫，李 超，王桂興，張曉彥，孫朝徽，王玉芬，姜秀鳳，劉海金

（1.中國水產科學研究院北戴河中心實驗站，河北秦皇島066100；2.上海海洋大學，上海201306；3.中國水產科學研究院，北京 100141）

1 前言

在一般情況下，硬骨魚類排出體外的成熟卵子處于第二次減數分裂中期。魚類的這種繁殖特征為魚類的細胞工程育種，例如：多倍體誘導、雄核發育誘導以及雌核發育誘導。人工誘導雌核發育是一種快速固定母本性狀、生產單性化苗種以及建立純系的有效手段。根據原理的不同，人工誘導雌核發育又可進一步被分為減數分裂雌核發育（Meiogynogenesis）和有絲分裂雌核發育（M itogynogenesis）。減數分裂雌核發育比有絲分裂雌核發育更易操作，有更高的誘導率，目前已經成功地應用于上百種魚類[1～3]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一種重要經濟魚類，雌性個體生長速度明顯比雄性快。中國水產科學研究院北戴河中心實驗站運用雌核發育誘導技術，選育的全雌牙鲆新品種“北鲆1號”和“北鲆2號”，具有雌性比例高、生長快、規格整齊、容易飼養等特點。關于牙鲆雌核發育的研究，已經有眾多論文報導[4～6]。王桂興等[7]采用微衛星技術，研究了牙鲆連續兩代減數分裂雌核發育家系的遺傳特征，結果顯示，第二代減數分裂雌核發育家系的純合度、個體間平均相似度以及親子間的平均相似度要略高于第一代雌核發育家系，顯著高于對照家系。

本研究在王桂興等[7]技術的基礎上，對性成熟的第二代雌核發育個體再度誘導減數分裂雌核發育，獲得三個連續三代減數分裂雌核發育家系，并利用 30對微衛星引物分析了該三個家系的純合度和遺傳相似度，旨在探討牙鲆連續多代雌核發育過程對等位基因純合進程的影響，為牙鲆通過連續多代減數分裂雌核發育方法建立純系以及優良品種選育提供相應的數據支持。

2 材料和方法

2.1 連續三代減數分裂雌核發育家系的構建

本實驗在中國水產科學研究院北戴河中心實驗站開展。2007年，以真鯛精子作為異源精子，經紫外線照射滅活，激活一尾雌性野生牙鲆所產卵子，并在激活后3m in，施以3℃，45m in的冷休克處理進行減數分裂雌核發育誘導，獲得第一代減數分裂雌核發育家系（Meio-G1）。2009年，利用Meio-G1內發育成熟的一尾個體再度誘導減數分裂雌核發育，獲得連續第二代減數分裂雌核發育家系（Meio-G2）。2014年，以Meio-G2家系內三尾性成熟個體進行減數分裂雌核發育誘導，獲得了三個連續三代減數分裂雌核發育家系（Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3）。

2.2 樣品采集與基因組DNA提取

采集作為母本的三尾Meio-G2的腹面胸鰭和Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3家系仔魚各30尾，置于100%酒精中固定，-20℃保存?；蚪MDNA提取采用傳統的酚-氯仿抽提法進行[7]。

2.3 微衛星引物

微衛星引物全部選自Coimbra等[8]繪制的牙鲆第二代遺傳連鎖圖譜，根據劉永新等[9]的實驗結果，選取重組率高、中、低的引物各10對，所選引物覆蓋牙鲆24個連鎖群。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列、退火溫度、M-C距離和Genbank登錄號見表1。

表1 30對微衛星標記位點引物序列、退火溫度、M-C距離和Genbank登錄號Table1 Primer sequences，annealing temperatures，M-C distance and accession number in Gen Bank of 30 microsatellite lociin the Paralichthys olivaceus

續表

2.4 聚合酶鏈式反應（PCR）擴增及電泳

PCR反應體系采用 15μL，包括：10×Buffer 2.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）1 μL、dNTPs（2 mmol/L）1μL、上下游引物（10mmol/L）各0.6μL、DNA模板1 μL（40～50 ng）、Taq DNA 聚合酶 1 U，加適量ddH2O。反應程序為94℃預變性4m in；共25個循環包括94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸8m in，PCR擴增在PE9700型PCR儀上進行。PCR產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后用HPScanjetG4010掃描儀成像，用Gel-Pro Analyzer4.5凝膠分析軟件對電泳圖像進行數據采集和分析。

2.5 統計指標

等位基因數（number of alleles，A）、觀測雜合度（Ho）、純合度（homozygosity）、遺傳相似系數（genetic similarity index，GSI）等遺傳參數均由 popgene（ver.3.2）計算獲得。重組率和近交系數由以下公式計算

重組率r=雜合子數/個體總數

近交系數

式（1）中，F為第i世代的近交系數；Gi為第i代雌核發育家系；r為微衛星位點的重組率。

3 結果與分析

3.1 PCR擴增及基因純合度

本研究選用的30對微衛星引物在Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個家系中均能擴增出穩定的PCR產物，所擴增到的等位基因數分別為35、38、37，平均等位基因數為1.17、1.27、1.23（見表2）。平均觀測雜合度（Ho）分別為0.146 7、0.255 6、0.205 6，平均純合度分別為0.853 3、0.744 4、0.794 4。t檢驗結果顯示，Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個家系間的平均觀測雜合度和平均純合度差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 30個微衛星座位上的等位基因數、觀測雜合度及純合度Table 2 Number of alleles，observed heterozy gosity and homo zygosity for the 30 microsatellite loci

3.2 連續三代減數分裂雌核發育家系內個體間的遺傳相似度

根據所檢測的30個微衛星位點的基因類型，分別計算了Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3家系內個體間的遺傳相似度（見表3）。結果表明，連續三代雌核發育家系內個體間平均遺傳相似度在0.983 8～0.991 8，顯示此群體已經是一個遺傳一致性很高的品系。另外，各家系母本與子代之間的平均遺傳相似度要高于子代之間的相似度。

表3 連續三代減數分裂雌核發育家系內的遺傳相似度Table3 Genetic similarity within family of the third successive meiogyno genetic generation

3.3 連續三代減數分裂雌核發育家系間的遺傳相似度

根據30個微衛星位點的基因型數據，計算了Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個家系間的遺傳相似度（見表4）。三個家系間的遺傳相似度在0.971 4～0.981 0，遺傳距離在0.019 1～0.029 0。三個家系之間均表現出高度的遺傳相似性。

表4 三個連續三代減數分裂雌核發育家系間的遺傳相似系數和遺傳距離Table 4 Genetic similarity and genetic distance among three third-generation of successive meiogynogenetic families in Japanese flounder Paralichthy solivaceus

3.4 不同微衛星位點的純合效率和近交系數

在三個家系中，30個微衛星位點分別檢測出5個、8個和7個多態性位點，多態性位點百分比為16.67、26.67、23.33，其余的各個位點，母本檢測到的為單態，只有一個等位基因，子代在這些位點的純合性和母本相同，完全純合固定。近交系數是衡量微衛星位點純合速率的一個指標，雜合位點在各家系的近交系數范圍為0～0.7（Meio-G3-1）、0～0.66（Meio-G3-2）、0～0.98（Meio-G3-3）。不同雜合位點在不同家系表現出不同的純合速率。比如，Poli1431TUF位點在Meio-G3-1和Meio-G3-2家系各觀測到10個和9個純合個體，而在Meio-G3-3家系中，只有兩個個體在此位點為純合；Poli1010TUF位點在Meio-G3-1家系中觀測到8個純合個體，而在Meio-G3-2和Meio-G3-3家系中卻沒有觀測到純合個體（見表5）。

表5 部分微衛星位點上純合個體數量、比率、重組率和近交系數Table5 Number of homo zygote，recombination frequency，coefficient of inbreeding(F)of some detected microsatellite lociin the third successive meiogynogenetic generation offspring Paralichthys olivaceus

4 結語

本研究首次報道了牙鲆三個連續三代減數分裂雌核發育家系的建立，并通過30對微衛星引物對這三個家系進行了遺傳特征的研究。結果表明，家系內個體間和家系間都具有高度的遺傳相似性。本研究中只選取一尾親魚的卵子，通過人工誘導減數分裂雌核發育，獲得減數分裂雌核發育一代家系Meio-G1，再隨機選取Meio-G1內一尾發育成熟雌性個體進行第二輪減數分裂雌核發育的誘導，獲得第二代減數分裂雌核發育家系Meio-G2。待Meio-G2家系雌魚性成熟時，再隨機選取三尾分別進行第三輪減數分裂雌核發育的誘導，從而建立了三個連續三代減數分裂雌核發育家系。每一代都只選用單一母本分別進行減數分裂雌核發育的誘導，在最大程度上確保了遺傳背景的一致性和等位基因代際純化的最大化，從而獲得遺傳相似度高的家系。

遺傳一致性高的動物品系對動物實驗的可靠性以及可重復性具有重要意義。在生物學研究中，獲得的實驗結果包含了處理效應、所用生物的遺傳變異、非遺傳變異以及各因素之間的互作。一個好的實驗設計是要控制和減少這些變異，從而讓處理的信息更加清晰和可靠。獲得具有高統計效力實驗結果的最佳方法是利用不同近交系具有遺傳異質性的少量個體進行實驗[10]。在動物中，建立近交系最常用的方法為全同胞交配法，運用此方法，建立一個近交系需要至少20代[11]。迄今為止，運用全同胞交配法，已經建立了數百個嚙齒類的近交系[12]。在斑馬魚上，一個連續16代的全同胞交配品系也已經被建立[13]。相比于傳統的全同胞交配法，人工誘導減數分裂雌核發育法具有快速固定母本性狀、提高等位基因純合速率等優點。一般認為，一代雌核發育相當于8～10代的連續全同胞交配[14]。在牙鲆上，一代減數分裂雌核發育相當于9～10個世代的全同胞交配，連續第二代減數分裂相當于11～12代全同胞交配[7]。本研究中，三個家系內子代間的平均遺傳相似度在0.981 3～0.991 8，家系間的平均遺傳相似度0.971 4～0.981 0。團頭魴（Megalobrama amblycephala）連續三代減數分裂雌核發育家系內個體間的平均遺傳相似度為0.984 5[15]，本研究結果與之相近。通過誘導連續三代雌核發育所獲得的個體，無論家系內，還是家系間，都具有高度的遺傳相似性，接近或略高于連續20代全同胞交配所獲得的理論結果（0.986）。因此，連續誘導多代減數分裂雌核發育能建立近交系，且比傳統的全同胞交配法更節省時間。

由于減數分裂過程中，存在著等位基因的重組，而且由于不同等位基因在染色體上的位置不同造成重組率的差異，導致了純合速率的差異，所以導致連續多代減數分裂雌核發育雖能一定程度加速等位基因純化的進程，但很難獲得所有位點全部純合的個體。將連續多代減數分裂雌核發育個體再進行一次有絲分裂雌核發育的誘導，將能獲得雙單倍體純合子。在牙鲆上，純合度高的個體比純合度低的個體具有更高的有絲分裂雌核發育誘導成功率。

綜上所述，通過連續三代減數分裂雌核發育誘導所獲得的牙鲆，具有高度的純合性和遺傳相似度，是進行牙鲆良種選育（quantitative trait locus）、QTL定位及其他遺傳學研究的優質材料。

[1] Arai K.Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan[J].Aquaculture，2001，197：205-228.

[2] Peruzzi S，Chatain B.Pressure and cold shock induction of meiotic gynogenesis and triploidy in the European sea bass，Dicentrarchus labraxL.：Relative efficiency of methods and parental variability[J].Aquaculture，2000，189：23-37.

[3] You C，Yu X，Tan D，et al.Gynogenesis and sex determination in large-scale loachParamisgurnus dabryanus(Sauvage)[J].Aquaculture International，2008，16：203-214.

[4] Yamamoto E.Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in Hirame flounder，Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)[J].Bulletin of Tottori Prefecture Fishery Experiment Station，1995，34：1-145.

[5] 劉海金，侯吉倫，常玉梅，等.真鯛精子誘導牙鲆減數分裂雌核發育[J].水產學報，2010，34(4)：508-514.

[6] Tabata K，Gorie S，Nakamura K.Studies on the gynogenesis in hirameParalichthys olivaceus.II induction of gynogenetic diploid in hirameParalichthys olivaceus[J].Nippon Suisan Gakkaishi，1986，52(11)：1901-1904.

[7] 王桂興，劉海金，張曉彥，等.牙鲆連續兩代減數分裂雌核發育家系的遺傳特征[J].中國水產科學，2012，19(3)：381-389.

[8] Coimbra M R，KobayashiK，Koretsugu S，etal.AGenetic linkage map of the Japanese flounder，Paralichthys olivaceus[J].Aquaculture，2003，220(1-4)：203-218.

[9] 劉永新，朱以美，劉英杰，等.牙鲆渤海自然群體的遺傳多樣性分析[J].水產學報，2013，37(11)：1609-1617.

[10] Festing M FW.The Design and statistical analysis of animal experiments[J].ILAR Journal，2002，43(4)：191-193.

[11] Casellas J.Inbred mouse strains and genetic stability：A review[J].Animal，2011，5(1)：1-7.

[12] Grimholt U，Johansen R，Sm ith A.A review of the need and possible uses for genetically standardized Atlantic salmon(Salmo salar)in research[J].Laboratory Animals，2009，43(2)：121-126.

[13] Shinya M，Sakai N.Generation of highly homogeneous strains of zebrafish through full sib-pair mating[J].G3(Bethesda)，2011，1(5)：377-386.

[14] 劉靜霞，周 莉，趙振山，等.錦鯉4個人工雌核發育家系的微衛星標記研究[J].動物學研究，2002，23(2)：97-105.

[15] 唐守杰，李思發，蔡完其.團頭魴連續三代減數分裂雌核發育群體遺傳變異的微衛星分析[J].淡水漁業，2014，44(2)：3-8.