大菱鲆神經肽Y基因克隆及其在工廠化養殖饑餓-投喂策略中的表達特征分析

韓 建，劉 濱，姜志強，穆小生，雷霽霖

(1.大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室，青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東青島266071；3.中國科學院動物研究所計劃生育生殖生物學國家重點實驗室，北京100101）

1 前言

神經肽Y（NPY）屬于胰多肽家族，此家族還包括多肽YY（PYY）、胰多肽（PP）和多肽Y（PY）等，NPY與由G蛋白偶聯受體構成的Y受體家族密切相關[1]。并且NPY與生物體的生長發育以及生活行為有很大的關系[2]，尤其是動物的攝食，是一種內源性的促進攝食的非常保守的神經遞質。NPY第一次在豬的腦部分離提取出來[3]，之后相繼在哺乳動物、鳥類、兩棲動物和魚中被鑒定檢測出來[4，5]。

NPY在心血管功能、生殖及應激和免疫反應中都發揮著生理效應[6～12]，其最重要的作用是促進攝食，這不僅在哺乳動物、鳥類和兩棲動物中得到證明[13～15]，在魚類中同樣得到了證明[16]，由此可推斷出NPY能夠反映各物種的攝食情況。

起初，NPY在硬骨魚類中的功能僅是作為促垂體激素釋放激素來研究的[17～20]，直至1998年，開始進行NPY在魚類攝食和能量平衡上的研究。Silverstein等[21]對大鱗大麻哈魚和銀大麻哈魚進行2～3周的饑餓實驗后導致其下丘腦中的NPY相似信使核糖核酸（mRNA）的表達量升高。López-Pati?o等[22]對金魚進行了研究，證明NPY可促進金魚的攝食。之后，該觀點相繼在斑點叉尾鮰[16]、美洲擬鰈[23]和大西洋鱈[24]等中得到證明。

大菱鲆屬于鲆科、菱鲆屬，是原產于歐洲北海、波羅的海和地中海沿岸的一種名貴比目魚，1992年由黃海水產研究所引進我國[25]。大菱鲆耐低溫、生長速度快、肉質鮮美，是重要的工廠化養殖經濟魚類之一。魚類攝食一直是研究的重點內容，大菱鲆作為典型工廠化養殖魚類，適宜的投喂不僅節約餌料，而且可避免過量的餌料對水質的污染。而NPY作為控制攝食和能量平衡的相關基因，對其結構和表達特征的研究很有必要。

本文以大菱鲆作為研究對象，克隆出NPY的全長互補脫氧核糖核酸（cDNA）序列并對其結構進行分析；同時進行NPY的組織特異性表達，并對大菱鲆進行饑餓和再投喂實驗，從而研究NPY在攝食調控中的表達情況。本文為進一步研究NPY基因和大菱鲆攝食的關系奠定了基礎，同時為進一步闡明魚類攝食調控的分子機理提供了理論依據，并且建立了一個可用來研究大菱鲆攝食的分子方法，以此為基礎在分子水平上研究魚類最適于攝食的環境因素并研發可促進大菱鲆攝食和生長的相關技術與產品。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

本文所用的健康大菱鲆取自煙臺天源水產有限公司?？寺〖敖M織表達所用大菱鲆的平均體重為（553.35±5.15）g，平均體長為（32.50±1.31）cm?；铙w帶回實驗室后，采用乙醚對其進行麻醉，置于冰上進行解剖，迅速分離腦組織各部分和肝臟等各組織，用RNAstore樣本保存液保存后，在4℃的冰箱中保存12 h后，放入80℃的冰箱中長期保存。

饑餓和再投喂實驗所用的大菱鲆為60日齡稚魚，平均體重為（5.5±0.02） g，平均體長為（2.6±0.5）cm，養殖水溫為15℃，正常光照，每天7點和17點各投喂1次微顆粒飼料，實驗前馴養2周。

2.2 方法

2.2.1 克隆策略和引物設計

利用美國國立生物技術信息中心（NCBI）Gen-Bank數據庫中已有的大西洋鱈魚、點帶石斑魚、牙鲆和美洲擬鰈等魚類的NPY序列保守區域，并結合Primer Primer 5.0，設計出擴增核心片段的一對引物F1和R1。并根據所得的核心片段設計5′末端快速擴增技術（RACE）所用的特異引物GSP1和進行巢式聚合酶鏈式反應（PCR）的引物NGSP1；用同樣的方法設計出3′RACE所用的特異引物GSP2和巢式引物NGSP2。

將所得到全長cDNA序列設計用于實時定量PCR的特異引物（qF1和qR1），并根據大菱鲆內參基因β-actin的基因序列設計引物（βf1和βr1），用于表達分析。所有引物由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成。以上引物具體序列見表1。

2.2.2 大菱鲆NPY基因的克隆

使用TRIzol Reagent（Ambion）從大菱鲆下丘腦中提取出總RNA。使用超微量紫外分光光度計測定RNA的濃度，并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性，利用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）進行反轉錄合成cDNA第一鏈。使用引物F1和R1進行中間片段的擴增，PCR程序為：94℃預變性5m in；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，運行35個循環；72℃延伸10m in。使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）對擴增所得片段進行分離純化，送到北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。使用SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit（Clonetech）進 行5′RACE和3′RACE，反應程序如下：94 ℃變性30 s，68℃退火30 s，進行25個循環；72℃延伸3m in。進行巢式PCR后獲得目的片段，經膠回收后，克隆到pMD? 18-TVector（TaKaRa）上，進行菌落PCR驗證后，對陽性克隆進行測序。

2.2.3 序列分析

使用DNAman 6.0對開放閱讀框（ORF）進行分析并推導出氨基酸序列，利用Prot Param工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.htm l）預 測NPY蛋白的基本理化性質，運用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對所推導出的氨基酸序列進行信號肽預測。運用ClustalX 1.83對不同物種的NPY氨基酸序列進行同源性比對，并用DNAstar中的MegA lign計算同源性，用MEGA4.0通過最大似然法構建NPY的系統進化樹。

2.2.4 大菱鲆NPY基因組織特異性表達

從大菱鲆的前腦、中腦、后腦、延髓、下丘腦、垂體、腮、心臟、肝臟、頭腎、腎、脾臟、肌肉、胃、腸及膽囊等16個組織，使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，使用用于實時定量PCR的反轉錄試劑盒TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）進行反轉錄，產物稀釋25倍后參照TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）說明書進行實時定量PCR。使用兩步法，反應程序如下：95℃預變性30 s；95 ℃ 變性5 s，62 ℃退火26 s，40個循環。反應結束進行溶解曲線分析以確定對目的片段是否進行特異性擴增。對每個樣品設置3個平行實驗，NPY基因和內參基因β-actin使用相同的模版量。

2.2.5 大菱鲆的饑餓和再投喂實驗

實驗用魚進行2周的馴養后，最后一次投喂后進行饑餓實驗，共分為兩組，第一組在喂食中（0 h）及喂食后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、48 h和72 h進行取樣，饑餓72 h后再次投喂并且于投喂中（0 h）和喂食后2 h進行取樣；第二組在饑餓48 h后進行再投喂，并同樣在投喂中（0 h）和喂食后2 h進行取樣（在喂食中取樣時允許在喂食15m in后再取樣）。取大菱鲆的下丘腦，實時定量PCR的方法如第2.2.4節所述。

2.2.6 數據分析

所得的Ct值通過2-ΔΔCt法計算NPY基因的相對表達量，并且使用SPSS18.0的one-way ANOVA進行差異顯著性分析（P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著）。

3 結果

3.1 大菱鲆NPY基因全長cDNA序列分析及結構特征

采用PCR技術獲得NPY基因的核心片段，再通過RACE方法得到兩端序列，進行拼接后得到的全長cDNA序列經tblastx分析確認為大菱鲆NPY序列。大菱鲆NPY基因cDNA全長729 bp，含有70 bp 的5′非翻譯區（5′-UTR）和359 bp的3′非翻譯區（3′-UTR），其中3′-UTR含有加尾信號ATTAAA及PolyA尾。ORF長300 bp，編碼含99個氨基酸的蛋白質，N端28個氨基酸為信號肽，信號肽后是由36個氨基酸組成的NPY成熟肽，后接蛋白質水解加工位點Gly-Lys-Arg，剩余32個氨基酸為NPY的羧基末端旁側肽段（CPON）（見圖1）。NPY蛋白的分子質量為11 301.9 Da，等電點p I為5.26，分子式為C516H799N131O150S2，脂肪系數（AI）為101.52，總平均輸水指數（GRAVY）為-0.284，不穩定系數（Ⅱ）為79.96，推斷此NPY蛋白不穩定。NPY蛋白的二級結構由48.48%的α-螺旋、45.45%的無規卷曲、3.03%的延伸鏈和3.03%的β轉角組成。

使用DNAstar軟件對大菱鲆NPY蛋白與其他物種的同源性進行比較，結果顯示大菱鲆NPY與其他物種的同源性在53.9%～98%，其中與牙鲆的同源性最高，為98%。使用ClustalX 18.3對序列進行比對，比對結果如圖2所示。進一步使用MEGA4.0構建NPY蛋白的系統進化樹（見圖3），根據所得進化樹分析可知，大菱鲆NPY蛋白與鰈形目（牙鲆和美洲擬鰈）和鱸形目（歐洲狼鱸和黑棘鯛）等一同位于硬骨海水魚類這一簇上，并且大菱鲆NPY蛋白與鰈形目（牙鲆和美洲擬鰈）基本處于同一分支；鯉形目（錦鯉和斑馬魚）和鯰形目（斑點叉尾鮰）處在硬骨淡水魚類這一簇上；軟骨魚類（石紋電鰩）、兩棲類（非洲爪蟾）、鳥類（紅原雞）及哺乳動物聚合為另一簇。大菱鲆NPY的分子進化地位與其生物學分類地位基本一致。

圖1 大菱鲆NPY的全長cDNA序列及所推導出的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of NPY from turbot

圖2 大菱鲆與其他物種NPY蛋白的氨基酸序列對比Fig.2 Contrast of the amino acid sequences of NPY from turbot and other species

圖3 根據NPY氨基酸序列使用最大似然法構建的系統進化樹Fig.3 Maximum-likelihood phylogenetic tree constructed with the amino acid sequences of NPY

3.2 大菱鲆NPY基因的組織表達

采用實時定量PCR對大菱鲆16個組織中NPY的表達量進行檢測。結果顯示，大菱鲆NPY基因分布廣泛，在16個組織中均有不同程度的表達（見圖4），在腦中的表達量相對較高，其中在下丘腦中的表達量最高，并與其他15個組織的表達差異顯著（P＜0.05），在肌肉、胃、腸及膽囊中的表達量相對較低，而在垂體、腮、心臟、肝臟、腎臟及脾臟中的表達量最低。

圖4 大菱鲆NPY基因的m RNA在不同組織中的表達Fig.4 Expression of NPYm RNA in different tissues of turbot

3.3 饑餓與投喂策略對大菱鲆NPY基因的表達影響

在饑餓實驗及再投喂實驗中，以饑餓實驗開始時（0 h）NPY基因的mRNA表達量作為對照，設為1。饑餓實驗的結果顯示，在0～4 h內，隨著實驗的進行，mRNA的表達量升高；在4～8 h內，隨著饑餓時間的延長，mRNA表達量呈現下降的趨勢；在8～48 h內，NPY基因的mRNA表達量又再次顯著升高，并且遠遠超過饑餓實驗前期（0～8 h）的mRNA表達量；然而在48～72 h內，NPY基因的mRNA表達量再次顯著下降（見圖5）。

圖5 饑餓對大菱鲆NPY基因的m RNA表達量的影響Fig.5 Effects of starvation on the expression of NPYm RNA in turbot

再投喂實驗結果顯示，饑餓48 h及72 h后再投喂，NPY基因的mRNA表達量相對于正常投喂組顯著升高，但同時又于投喂2 h后呈現顯著的下降趨勢（見圖6）。

圖6 饑餓后再投喂對大菱鲆NPY基因的m RNA表達量的影響Fig.6 Effects of refeeding after starvation on the expression of NPYm RNA in turbot

4 討論

本文通過使用逆轉錄PCR（RT-PCR）和RACE技術，從大菱鲆的腦組織中得到全長為729 bp的NPY cDNA序列，編碼99個氨基酸組成的NPY蛋白，其中36個氨基酸組成NPY的成熟肽，這與其他物種的結果一致[3]。大菱鲆NPY的氨基酸序列跟其他魚類相比，表現出較高的同源性，特別是與同屬于鲆鰈魚類的牙鲆及美洲擬鰈的同源性高達97%～98%。并且根據所得進化樹分析可知，大菱鲆NPY蛋白位于硬骨海水魚類這一分支上，與鰈形目（牙鲆和美洲擬鰈）和鱸形目（歐洲狼鱸和黑棘鯛）等的關系較近；與鯉形目（鯉魚和斑馬魚）、鯰形目（斑點叉尾鮰）、軟骨魚類（石紋電鰩）、兩棲類（非洲爪蟾）、鳥類（紅原雞）及哺乳動物的關系較遠，這與同源性分析基本一致。在大菱鲆NPY成熟肽中不含半胱氨酸（C），只在信號肽第21個氨基酸位點上有一個半胱氨酸（C），并且在序列比對結果中，信號肽的第21個氨基酸位點上都為半胱氨酸（C）。比對結果顯示，NPY成熟肽的36個氨基酸中有26個高度保守，這說明NPY是一種進化十分保守的神經肽。

通過實時定量PCR技術研究發現，NPY基因在大菱鲆神經組織特別是下丘腦中的表達量較高，這與其他物種的研究結果一致。下丘腦外側區（LHA）為攝食中樞（也稱饑餓中樞），起著決定發動攝食活動的作用；腹內側核（VMH）為飽食中樞，起著決定停止進食活動的作用[26]。NPY基因mRNA在下丘腦中的表達最高，說明NPY可能與攝食和能量平衡的調節有關。NPY在神經組織中的表達量較高，在外周組織中也有表達，但不同物種間外周組織中NPY的表達量略有不同。在大菱鲆外周組織中NPY在肌肉、胃、腸及膽囊中的表達量相對于在垂體、腮、心臟、肝臟、腎臟及脾臟中的表達量較高，由此可推斷在大菱鲆中NPY可能是腦-腸肽，這在其他魚類中已得到相應的證明[24，27～29]。在腎臟中也檢測到了NPY的存在，由此可得出NPY有可能與大菱鲆的滲透調節有關。大菱鲆NPY基因在消化系統（胃和腸）中的表達是除中樞系統（腦部等）外表達量最高的，這與其他物種的研究結果相一致[6]。

饑餓實驗中，隨著饑餓的進行，NPY的表達量顯著變化（P＜0.05），呈現先升高再降低，再顯著升高并維持一段高水平表達后，再次下降的趨勢，說明NPY跟大菱鲆的攝食相關，并且饑餓只能暫時提高NPY的表達量；在再投喂實驗中，饑餓后再投喂會使NPY的表達量升高，并且饑餓時間越長，再投喂后NPY的表達水平越高，但是再投喂2 h后表達量還會再次下降至相似的水平，這都預示著NPY對攝食的調控可能是一種短期的調控機制。大菱鲆饑餓12 h后，NPY基因的表達水平開始顯著上升；而金魚饑餓72 h后，NPY基因的表達量才開始顯著升高；鯰魚則需要至少三周的時間，NPY基因的表達水平才會出現變化[16，21]，這說明可能不同魚類的耐饑餓程度及NPY的對攝食調節的強度不同。攝食0 h后和攝食2 h后的NPY的表達量會發生顯著變化，這說明可能NPY不參與攝食后的消化過程，只是起到了刺激食欲的作用。NPY基因對饑餓的生理效應與其他攝食刺激因子相一致，如Orexin[30]、AgRP[31]和ghrelin[32]，與其他攝食抑制因子的生理效應相反，例如 CART[24，33]和 POMC[34，35]。

這些結果表明，NPY參與大菱鲆的攝食調控，并且可能起到促進攝食的作用。

5 結語

本文首次克隆了大菱鲆的NPY基因并對其結構和表達特征進行了初步研究。大菱鲆NPY基因在神經組織中的表達水平較高，并且在下丘腦中有最大表達量，這與其他脊椎動物的實驗結果相一致，但NPY在不同物種的外周組織中的表達量有所變化。在饑餓和再投喂實驗中，初步得出大菱鲆NPY是一種促進攝食的食欲刺激因子，與其他物種的研究結果相一致。但是，NPY促進攝食的相關分子機制還有待進一步研究。

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