雙單倍體牙鲆的性腺發生、性別分化及早期發育的研究

王桂興，朱以美，侯吉倫，張曉彥，王玉芬，孫朝徽，姜秀鳳，劉海金

(1.中國水產科學研究院北戴河中心實驗站，河北秦皇島066100；2.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱150030；3.中國水產科學研究院，北京100141)

1 前言

牙鲆（Paralichthys olivaceus）肉質細嫩、味道鮮美，同時它還具有生長快、繁殖能力強、洄游性小和回歸性強的特點，是中國、日本、韓國等國家重要的海水增養殖魚類[1]。牙鲆雌雄個體差異較大，雌魚的生長速度明顯快于雄魚。人工養殖條件下這種差異更加顯著。在生產中，養殖全雌牙鲆比養殖普通牙鲆能大幅度提高養殖產量，從而獲得更大的經濟效益。因此，人工誘導雌核發育，實現牙鲆養殖全雌化，對提高養殖產量和經濟效益具有非常重要的意義[2]。根據不同的處理原理，雌核發育可分為減數分裂雌核發育和有絲分裂雌核發育。有絲分裂雌核發育能夠產生雙單倍體，再次誘導雌核發育，即可獲得克隆牙鲆。

從20世紀60年代以來，我國學者對魚類性腺發育的研究有許多報道，多數集中在性腺發育的分期和季節變化規律方面，直到現在許多學者還在致力于此方面的研究。但是，對魚類性別分化的研究較少，且大多集中在淡水魚類，而對海水魚類的研究則更少[3，4]。關于雙單倍體牙鲆的性腺發生、分化及發育的研究，至今未見報道。

本文對雙單倍體牙鲆的性腺發生、性別分化及早期發育過程進行組織切片觀察，對其性比及性腺組織學特征進行了描述和分析，旨在為研究雙單倍體牙鲆的繁殖生物學提供組織學上的依據。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本實驗的親魚取自中國水產科學研究院北戴河中心實驗站，是2007年生產的普通牙鲆，5齡，體質量為4.17 kg，全長70 cm。利用親魚的同一批卵子，誘導有絲分裂雌核發育、減數分裂雌核發育和對照組。有絲分裂雌核發育，用紫外線滅活的真鯛精液激活卵子，靜置3 m in后加入17℃海水培育60min，然后轉移至靜水壓機（5406R，大岳公司，日本）中，施壓650MPa，持續6m in，完成雌核發育誘導后，移至常溫海水中孵化。減數分裂雌核發育，用紫外線滅活的真鯛精液激活卵子，靜置3m in后轉入0℃海水中培育30m in，然后移至常溫海水中孵化。對照組為精卵通過干法受精方式獲得。受精卵分別培育在0.5m3的孵化缸中，開始培育水溫16℃。30天后轉入3m3的大孵化缸中培育，采用常規方法進行培育，投喂餌料依次是輪蟲、鹵蟲和配合餌料。

2.2 性別分化樣品的采集

初孵仔魚自孵出后第10天開始取樣，10～80天，每5天隨機取樣5尾；80～110天，每10天隨機取樣5尾。對照組和實驗組分別取樣，每組分別取樣90尾。對所取樣品進行稱重和照相。分別取頭尾放于波恩試液中固定12 h，之后存放在濃度為70%的酒精中。

2.3 性腺發育樣品的采集

性別分化110天后，每月隨機取樣5～10尾，至18月齡結束。由于有絲分裂雌核發育牙鲆特別珍貴，所以筆者在保證實驗順利進行并能充分說明所要研究問題的同時取樣較少。對所取樣品進行稱重和照相。取性腺的前、中、后部放于波恩試液中固定24 h，之后存放在濃度為70%的酒精中。

2.4 組織切片

將固定好的樣品用70%的酒精沖洗，然后梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟（熔點為56～58℃）包埋，連續切片，厚度為5μm。采用蘇木素-伊紅（H.E）染色，中性樹膠封片。組織切片用Leica光學顯微鏡觀察并顯微攝影。

2.5 組織切片觀察方法

本文將牙鲆性腺分化的組織學特征卵巢腔的形成作為雌性性別分化開始的依據，沒有觀察到其他研究者看到的輸精管原基，把沒有卵巢腔形成的認為是精巢。以Ⅰ時相卵母細胞的出現作為卵巢分化完成的標志；而以精巢中初級精母細胞的出現作為精巢分化完成的標志。觀察有絲分裂雌核發育牙鲆的性腺分化與普通牙鲆的性腺分化的不同，包括性別分化開始時間、性別分化完成時間、卵原細胞的數目和精原細胞的數目等。

本文以施瑔芳等[5]提出的劃分標準和劉筠[6]提出的劃分標準為基礎，結合張耀光等[7]的觀點，并依據牙鲆卵母細胞及精母細胞自身發育的特點，劃分牙鲆卵母細胞時相及精巢的分期。卵巢發育分期依卵巢切面中所占面積超過50%或比例最高的卵母細胞的時相進行劃分。比較有絲分裂雌核發育與普通牙鲆性腺發育的不同，包括各個時期卵母細胞的形態特點、細胞質的不同、細胞核的不同及數目，以及精巢中各個時期精小葉、精小囊的形態特點、精原細胞的數目以及初級和次級精母細胞的數目等。

3 結果與分析

3.1 雙單倍體牙鲆原始性腺的發生

普通牙鲆15～35日齡的仔魚，全長8.3～17.9mm，腹腔后端向腹腔內形成突起并逐漸延伸，形成生殖嵴；隨著日齡增大，全長增加，生殖嵴內原始生殖細胞（PGCs）數目增加，35日齡時增加到5～6個，位于中腎管附近，與生殖嵴共同構成性腺原基；原始生殖細胞體積大，要比正常的體細胞大很多，細胞核被染成紫色，核染色較深，胞質著色較淺，細胞界限明顯。35～45日齡，仔魚全長17.9～27.4mm，性腺長度前期增加，后期變化不大，但是明顯變寬，原始生殖細胞數量增加，排列變得稍微緊密，細胞直徑變大；45日齡時，性腺內出現微血管。此時仍不能分清精巢或卵巢，隨后，性腺進入分化階段。減數分裂雌核發育牙鲆原始性腺的發生和普通牙鲆基本相同。

雙單倍體牙鲆30～40日齡的仔魚，全長10～21mm，原始生殖細胞由1個增加到4個。分布在生殖嵴內，兩者共同構成性腺原基，性腺呈長條狀，向腹腔內延伸。40～55日齡，仔魚完成變態，全長21～38mm，性腺繼續延伸變寬，原始生殖細胞數量增加，在性腺內部排列逐漸緊密，原始生殖細胞逐漸增大；55日齡時，性腺內出現微血管，但仍不能辨別雌雄（見圖1）。

圖1 30～55日齡雙單倍體牙鲆的原始性腺Fig.1 Primordial gonad of 30～55 day sold doubled haploid Paralichthy solivaceus

3.2 雙單倍體牙鲆的性別分化

3.2.1 卵巢的分化

普通牙鲆50日齡，全長41.2mm，性腺有像卵巢發育的跡象，中間出現卵巢腔，一端向另一端延伸，最后兩端逐漸靠近，閉合后中間形成腔隙；背側基部有微血管。60日齡，全長50mm，卵原細胞增多，排列在性腺的邊緣，血管增多。70日齡，全長86.8 mm，性腺一端逐漸卷曲延伸，形成產卵板，卵原細胞沿著產卵板緊密排列。80日齡，全長92.5 mm，卵原細胞繼續增多，細胞體積逐漸變大，形成向卵母細胞過渡的細胞，繼續卷曲延伸形成產卵板，卵巢腔未閉合。90日齡，全長114mm，個別開始出現Ⅰ時相卵母細胞，細胞體積變大，含有2～3個核仁，分布于核周邊，細胞質嗜堿性增強，沿卵母細胞邊緣均勻分布。100日齡，全長135.7 mm，大部分卵巢都出現Ⅰ時相卵母細胞，同時細胞數目增多，至此，卵巢分化完成，屬于Ⅰ卵巢。卵巢腔形成是卵巢分化的標志，Ⅰ時相卵母細胞的出現是卵巢分化完成的標志。減數分裂雌核發育牙鲆卵巢的分化和普通牙鲆基本相同。

雙單倍體牙鲆60日齡，全長47mm，性腺開始向卵巢發育，一端向另一端卷曲延伸，中間形成腔隙，慢慢閉合形成卵巢腔；有微血管出現（見圖2a）。70日齡，全長64.2mm，性腺一端繼續延伸，形成產卵板，卵原細胞沿著邊緣分布，血管增多（見圖2b）。80日齡，全長87.3mm，產卵板數目逐漸增多，卵原細胞數量也增加，同時細胞的體積增大，逐漸向過渡細胞轉變，細胞沿著產卵板分布。90日齡，全長104mm，產卵板和卵原細胞數目都繼續增多，在產卵板上緊密排列。細胞體積也進一步增大（見圖2c）。100日齡，全長122mm，產卵板數目繼續增加，但卵巢腔仍未閉合，未見Ⅰ時相卵母細胞出現（見圖2d）。110日齡，全長132mm，產卵板上存在大量的卵原細胞向卵母細胞過渡的細胞，但仍未見有Ⅰ時相卵母細胞出現（見圖2e）。

圖2 60～110日齡雙單倍體牙鲆的卵巢Fig.2 Ovary of 60～110 day sold doubled haploid Paralichthys olivaceus

3.2.2 精巢的分化

雙單倍體牙鲆和普通牙鲆在精巢分化時間上基本相同。全長42.6～51.5mm、55日齡的幼魚中，沒有出現卵巢腔裂隙的那一類型的性腺則沒有明顯變化，整個性腺呈長條狀（見圖3a）。筆者認為像這樣沒有變化的性腺將發育成精巢。60～80日齡，全長55～87mm，精巢繼續延伸、變寬，精原細胞有所增加（見圖3b）。90日齡，全長100mm，精原細胞聚集成簇，形成囊狀結構，將會發展成為精小葉，精小葉間基質內有微血管分布，精原細胞數目大量增加（見圖3c）。100日齡，全長122mm，精巢內精小葉結構清晰可見，出現初級精母細胞，還有少量次級精母細胞，標志著性腺分化完成（見圖3d）。

3.3 雙單倍體牙鲆的性腺發育

3.3.1 卵巢的發育

牙鲆具有一對卵巢，呈圓錐狀，一般情況下呈左右對稱狀分布。但是在雙單倍體牙鲆中，卵巢經常出現不對稱分布的情況，形態包括：缺少一邊，只剩左支；性腺一端彎曲折疊；性腺左右兩端一大一小等。牙鲆左右卵巢各延伸出一條輸卵管，在臨近生殖孔處匯合，并開口于生殖孔。根據卵巢發育過程中生殖細胞形態、結構的變化及特點將其分為以下幾個時期。

1）Ⅰ期，3～5月齡，卵巢內的細胞主要由卵原細胞、Ⅰ時相卵母細胞以及由卵原細胞向Ⅰ時相卵母細胞過渡的細胞組成。卵原細胞小且圓，細胞質區域顯著，核仁明顯，細胞聚集成團。卵原細胞不斷增值。Ⅰ時相卵母細胞原生質和細胞核開始增大，細胞質被蘇木素染成淡紫色，核膜界線清晰，核膜邊緣有1～3個染色很深的核仁，觀察到核質內有絲狀的物質，似染色體殘跡。過渡的細胞其細胞直徑介于卵原細胞和卵母細胞之間，由卵原細胞緩慢過渡到卵母細胞。

圖3 55～110日齡雙單倍體牙鲆的精巢Fig.3 Testisof 55～110 daysold doubled haploid Paralichthys olivaceus

2）Ⅱ期，6～18月齡，根據卵巢內卵母細胞直徑、油球、生長環和卵黃核的出現，以及核仁數目的變化，將Ⅱ時相卵母細胞劃分為早、中、晚3個時期。6～10月齡的卵巢為早期卵巢，與Ⅰ期相比，卵母細胞體積增大，呈圓形或橢圓形，細胞質區域增大，被蘇木素染成深紫色，靠近核膜處出現油球，在細胞核邊緣分布3～6個大核仁不等。11月齡的卵巢為早期向中期過渡的卵巢，可見卵母細胞體積進一步增大，核質比變小，核仁數目增加，油球數目增加，并聚集成塊，個別卵母細胞出現卵黃核，正向Ⅱ期中期過渡。12～16月齡的卵巢為中期卵巢，卵母細胞體積進一步增大，在性腺中排列緊密，成不規則形狀，油球數目增多，沿著細胞核周圍分層排列，部分卵母細胞、油球在靠近細胞質外緣圍成一圈，把細胞質分成內外兩層；核仁數目增加，核仁與前期相比變小，數目增加至7～20個不等，細胞核中間出現似染色質的物質，呈團狀，個別有卵黃核出現。18月齡為中期向晚期過渡階段，細胞體積進一步增大，呈橢圓形或不規則形狀，油球繼續增多，分層聚集成塊，細胞質染色出現分層現象，靠近卵核處染成淺紫色，而靠近卵膜處染成深紫色；核仁排列在細胞核的邊緣，數目增加，出現卵黃核。

與普通牙鲆相比，雙單倍體牙鲆的Ⅰ期卵巢發育過程沒有差異，3～5月齡卵巢內的細胞主要由卵原細胞、Ⅰ時相卵母細胞以及由卵原細胞向Ⅰ時相卵母細胞過渡的細胞組成（見圖4a）。

普通牙鲆的Ⅱ期卵巢，6～17月齡，同樣根據卵巢內卵母細胞直徑、油球、生長環和卵黃核的出現，以及核仁數目的變化，將Ⅱ時相卵母細胞劃分為早、中、晚3個時期。6～9月齡為早期，卵母細胞體積增大，細胞多呈圓形或橢圓形，在近核膜處出現油球，在核膜邊緣分布3～6個不等的大核仁。10～12月齡為中期，卵母細胞的體積進一步增大，在性腺中排列緊密，呈不規則形狀，油球數目增多，沿著細胞核周圍分層排列，部分卵母細胞、油球在靠近細胞質外緣圍成一圈，把細胞質分成內外兩層。核仁數目增加至7～17個。細胞質染色出現分層現象，靠近細胞核部分染色較淺，而靠近核膜處染色較深。13～18月齡為晚期，細胞體積繼續增大，呈不規則多角形，出現卵黃核，卵黃核周圍細胞質被溶解，核仁數量增加，核膜模糊。

圖4 雙單倍體牙鲆卵巢的發育Fig.4 Ovary development of doubled haploid Paralichthy solivaceus

雙單倍體牙鲆卵巢中發育異常的卵母細胞主要是形態結構的改變：a.通過各個時期雙單倍體牙鲆性腺與普通牙鲆性腺的對比，性腺中的嗜堿性細胞增多，不見細胞核，只見一個個被染成深紫色的細胞；b.細胞核中出現不規則的嗜堿性結構，中空的U形結構；c.細胞質出現分層現象，表現為內外兩層，且相互分離，內層染色深，外層染色淺，內層聚集成團，看不清內部結構；d.退化的卵巢，能看到卵巢腔和產卵板的結構，分布著極少量血管和細胞，沒有卵母細胞，因此不能分清發育到哪期，筆者把這類卵巢叫做退化卵巢；e.敗育的卵巢，能看到卵巢腔和產卵板的結構，性腺組織被染成紅色，有非常少的血管分布，不見任何細胞，故稱此類卵巢為敗育卵巢（見圖4f～圖4h）。

3.3.2 精巢的發育

牙鲆精巢位于體腔后緣、中腎后方，與中腎相連，根據精巢發育過程中生殖細胞形態、結構的變化及特點將其分為以下幾個時期。

1）Ⅰ期，與普通牙鲆發育時期及特點相同，2～3月齡，精巢形成許多精小葉，每個精小葉內鑲嵌2～4個精原細胞，小葉基質中有微血管。精原細胞呈圓形或橢圓形，核大，位于中央或邊緣，細胞質染色淺，在其一生中Ⅰ期精巢僅出現一次。

2）Ⅱ期，與普通牙鲆發育時期及特征也沒明顯差異，4～5月齡，精小葉略顯增大，小葉間結締組織增多，精原細胞數目迅速增加，緊密排列于精小葉中，處于增值期；并出現少量初級精母細胞，初級卵母細胞與精原細胞相比，體積變小，細胞核染色深。

3）Ⅲ期，6～11月齡，精小葉體積增大，精小葉間結締組織變薄。早期，6月齡，精小葉內充滿了精原細胞和初級精母細胞，以及少量次級精母細胞；中期，7～8月齡，可見含有大量初級精母細胞和次級精母細胞的精小囊，還有少量精子細胞；末期，9～11月齡，可見精子細胞增多，同時含有大量的初級和次級精母細胞，精原細胞和初級精母細胞沿著精小葉邊緣分布，此期為向Ⅳ期精巢過渡階段。初級精母細胞的體積小于精原細胞，次級精母細胞的體積小于初級精母細胞，由初級精母細胞分裂而來；精子細胞的體積小于次級精母細胞，由次級精母細胞分裂而來?？梢钥吹?，精原細胞分布在精小葉的邊緣，精小葉內的細胞發育是不同步的，而精小囊內的細胞發育是同步的。與普通牙鲆相比，雙單倍體牙鲆Ⅲ期精巢發育較慢，普通牙鲆性腺在同期進入了Ⅳ期，主要特征就是精小葉間結締組織變薄，精小葉內充滿大量正在變態的精子細胞和精子，以及大量的初級和次級精母細胞，精小葉之間相互連通或貫穿（見圖5a和圖5b）。

圖5 雙單倍體牙鲆精巢的發育Fig.5 Testis development of doubled haploid Paralichthy solivaceus

11月齡，觀察到其中1尾雙單倍體牙鲆精巢有退化的趨勢，精子細胞與前期相比減少，精小葉內含有大量的精原細胞和初級精母細胞（見圖5c）。

13～15月齡，雙單倍體牙鲆與普通牙鲆差別很大，精巢發生退化（見圖5d）。13月齡的主要特征是次級精母細胞和精子細胞消失，精小葉內被大量的精原細胞及少量的初級精母細胞填充。其中有1尾發育正常的雙單倍體牙鲆，特征是精小葉內出現空腔，此空腔應該是精子排出以后殘留的，還含有大量的精原細胞、初級精母細胞以及少量的次級精母細胞。14～15月齡的主要特征是精小葉內只含有精原細胞，初級精母細胞消失不見，似Ⅱ期精巢（見圖5e和圖5f）。

16～18月齡，部分雙單倍體牙鲆精巢發育正常，精小葉中出現空腔，似是精子排出后留下的，同時還含有大量精原細胞和初級精母細胞，以及少量的次級精母細胞和精子細胞（見圖5g）。但此期并不完全像排出精子后的精巢，普通牙鲆精子排出后，精小葉萎縮，只含有殘存的精子、精原細胞和初級精母細胞，特征與所觀察到雙單倍體牙鲆性腺有差距。此外，還有部分精巢仍處于退化階段。

18月齡，觀察到1尾雙單倍體牙鲆精巢敗育，從切片可以看出精小葉結構以及精小葉內出現很多空腔，但是觀察不到任何細胞結構，也就是說沒有精原細胞，故稱此類精巢為敗育精巢（見圖5h）。

4 討論

4.1 雙單倍體牙鲆的性比

牙鲆的性別決定機制是XX-XY型，在XX-XY性別決定的魚類中，雌核發育后代預期是全雌的。本研究中，在79尾實驗魚中，雌魚44尾，占群體總數的55.7%；雄魚30尾，占群體總數的37.9%；雌雄魚比例為1∶0.68，與預測結果存在很大的偏差。導致該結果的原因一部分可能歸結于環境因素壓制了性別決定體系，還有一些實驗表明隱性突變影響性別決定。雙單倍體出現雄性的例子有很多，雙單倍體斑馬魚主要是雄魚，甚至是雙單倍體雌魚誘導雌核發育都能生產全雄的克隆系[8，9]。斑馬魚中這種異常的性比似乎是一個重要的事實，所有的動物開始都發育成雌魚，而后會有一部分波動比例改變性別變成雄魚[10]。尼羅羅非魚的性別決定是XXXY型[11]，但是可能受溫度的影響[9，12]，雙單倍體中出現較高的雄魚比例，比例高達35.3%。Müller-Belecke和H?rstgen-Schwark[9]認為存在1～2個較小的性別決定因素，當這幾個性別決定因素發生在純合子狀態時可能推翻XX-XY機制。Sarder等[13]認為在雙單倍體出現雄魚的這些群體中存在不止一個較小的性別決定位點的分離。Karayücel等[14]發現在尼羅羅非魚中存在著一個能引起雌魚變為雄魚的性逆轉基因，且此基因和控制紅色體色的基因相關聯。魚類的性別決定是個相當復雜的過程，不僅受遺傳影響，還與其所在環境、行為和生理因素等有關[12]。本實驗未能對雙單倍體牙鲆中出現雄性的原因進行說明，因此還需設計實驗對其產生的原因進行研究。

4.2 雙單倍體牙鲆的性腺分化

多數魚類的性腺分化不僅與日齡相關，還與全長密切相關。日齡越大，全長越長，性腺發育越明顯。不同魚種性腺分化時間差別很大，同一種魚的性腺分化時間也可能不同，Yamamoto[15]報道牙鲆性腺分化的全長是27～37mm；而Tabata[16]報道的全長為30～100mm；孫鵬等[17]報道的全長為38mm；孫朝徽[18]報道的全長為33.8mm。本研究普通牙鲆全長41mm時才開始向卵巢分化，而雙單倍體牙鲆全長47mm時才開始分化。這可能是誘導處理和培育水溫不同導致的。本研究觀察到雙單倍體牙鲆與普通牙鲆的性腺分化時間有差異，但是并未找到出現這種現象的具體原因，還需設計實驗進行具體的觀察研究。

4.3 雙單倍體牙鲆性腺的退化及敗育

本研究中，觀察到精巢退化的現象。該現象可能是隱性有害基因純合并表達引起的，可能是單基因控制，可能由多基因共同決定，也可能與Y染色體的缺失有關。本研究的結果與周丹[2]研究的結果相似。筆者并未對其產生的原因進行研究，還需要設計實驗進行進一步的研究。同時，觀察到1尾雙單倍體牙鲆精巢敗育。造成精巢敗育的原因可能與隱性有害基因的純合或Y染色體的缺失有關，也可能是兩者共同決定的。由于此類精巢數目很少，還需要進一步的驗證及研究。

本研究中，觀察到一尾雙單倍體牙鲆卵巢退化和一尾雙單倍體牙鲆卵巢敗育。由于所觀察的此兩類卵巢數目很少，而且在其他魚類中也沒有此種現象的報道，所以筆者分析造成這種現象的原因可能與基因純合并表達有關，也可能是由于突變基因的影響，還需進一步設計實驗進行證明。

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