半滑舌鰨促黃體激素基因克隆和表達分析及其血清濃度測定

柳學周，史 寶，王珊珊，徐永江，李曉曉

（中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室，青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東青島266071）

1 前言

脊椎動物生殖活動主要受下丘腦—腦垂體—性腺軸（HPG）3個不同層次的內分泌系統調控。促性腺激素（GTH）是由垂體合成和分泌的一類糖蛋白激素，在魚類的性腺發育、性類固醇及多肽類激素調控中起著至關重要的作用。腦垂體GTH包括促濾泡激素（FSH）和促黃體激素（LH），它們是異源二聚體，都是由α和β亞基以非共價鍵相連組成的二聚體結構，其中α亞基氨基酸組成相同，而β亞基明顯不同，具有特異的生物學作用。

通過對大馬哈魚（Oncorhynchusketa）GTH生物學功能的研究，發現兩種GTH在表達模式及生殖周期不同發育階段的水平有所不同[1]。生理學研究表明，LH主要調控性腺成熟及排精/排卵[2～4]。LH由腦垂體前葉細胞分泌，通過血液循環到達性腺及其他組織，魚類LH相應生物學功能及水平的變化規律已有報道。用放射免疫法測定虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）[5]的GTH，發現LH在排精及卵母細胞最終成熟和排卵時大量分泌并達到最高峰，促使卵母細胞和精子最終成熟并刺激排卵排精。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）是重要的海水養殖經濟魚類，屬秋季產卵型魚類[6]，自然繁殖季節為9—10月份，卵巢內卵母細胞發育不同步，是分批成熟多次產卵類型魚類[7]。近年來，半滑舌鰨生殖調控及規?；斯し庇夹g的研究獲得重大突破[8]。目前，國內外多種硬骨魚類的LH cDNA序列已成功克隆，包括鯉形目[9]、鱸形目[10]、鰻鱺目[11]和鮭形目[12]等，但關于半滑舌鰨LH的研究尚未見報道。本文應用分子生物學和碘（125I）放射免疫分析法（RIA），克隆得到半滑舌鰨LH的全長cDNA序列，對其mRNA組織表達及繁殖周期表達特征進行分析，并檢測血漿LH在雌性半滑舌鰨繁殖周期的變化規律，揭示其可能的生理功能，以期為魚類促性腺激素及生殖內分泌調控的研究提供科學依據，為提高半滑舌鰨全人工育苗和轉季節育苗的生殖調控效率提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗用半滑舌鰨于2011年6月—2012年1月采自青島忠海水產有限公司。實驗魚為野生親魚自然產卵后，人工育苗得到的健康苗種，經室內人工養成達到性成熟年齡的F1代親魚。研究用15尾雌性親魚全長53～66 cm，體重1 266.3～2 271.0 g。親魚培育條件：全年開放流水培育，人工調控親魚發育及產卵過程，產卵前2個月左右進行親魚強化培育。水溫由20℃逐漸提高到25℃，并使用遮光幕和白熾燈進行光照強度和光照節律的調節，控制光強200～300 lx，光照時間由8 h/d逐漸增加到12 h/d[13]。將半滑舌鰨各組織樣品取出，迅速于液氮中凍存，并轉入-80℃冰箱保存備用，取樣操作要避免各樣品間的交叉污染。Davidedsons液固定卵巢組織用于組織學觀察。

2.2 藥品和試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus、Taq酶、DNaseⅠ（RNasefree）、RNasin、SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa公司，SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒、Advantage 2 PCR試劑盒購自Clontech公司，E.Z.N.AGelExtraction Kit普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自OMEGA公司，pEASY-T1載體、Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞購自全式金公司，其余均為國產分析純。所有PCR引物由TaKa-Ra公司合成，序列由北京華大基因公司測定。血漿中LH含量的測定，試劑盒Iodine[125I]-LH RIA Kit購自天津九鼎醫學生物工程有限公司。

2.3 卵巢組織學分析

卵巢組織經常規梯度乙醇脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋。LEICA RM 2235型切片機（德國）切片，厚度為5～7μm，H.E染色，中性樹膠封片，LEICA DW 4000B型顯微鏡（德國）下觀察及顯微攝影。參考半滑舌鰨卵巢發育組織學研究中的分類標準[14]，確定卵巢發育情況。

2.4 總RNA的提取和cDNA的合成

取-80℃保存的半滑舌鰨各組織：腦、垂體、鰓、心、頭腎、腎、肝、脾、胃、腸、卵巢、肌肉各50～100 mg，用RNAiso Plus抽提總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，采用Nanodrop2000（美國Thermo公司）測定總RNA濃度。各組織RNA經反轉錄合成cDNA第一鏈，于-20℃保存備用。

2.5 半滑舌鰨LH基因克隆

-20℃保存的cDNA作為PCR模板，通過RTPCR反應獲得半滑舌鰨LH基因的保守片段，所用引物為LHF和LHR。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收純化PCR產物（操作步驟嚴格按照OMEGA公司膠回收試劑盒說明書）?；厥债a物與pEASY-T1克隆載體連接，重組子轉化至Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞，在含氨芐青霉素的LB平板上37℃培養過夜，挑取陽性克隆送至北京華大公司測序。

根據擴增得到的序列設計特異性引物LHGSP1、LHNGSP1（5’RACE）和 LHGSP2（3’RACE），應用SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒克隆半滑舌鰨LH cDNA全長。提取新鮮垂體組織總RNA，用于5’-RACE及3’-RACE cDNA第一鏈合成，合成的cDNA第一鏈分別用Advantage 2 PCR試劑盒（Clontech公司）進行PCR擴增。PCR反應體系25μL，反應條件為94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃2 m in，共25個循環。取5μL產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，再次對目的條帶進行回收、與載體連接、轉化、篩選陽性克隆并測序。實驗中所用的引物見表1。

2.6 序列分析

Dnastar軟件分析蛋白分子量和等電點；所得序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，分析半滑舌鰨LH與其他物種的LH同源性高低；從GenBank中選擇脊椎動物哺乳綱和魚綱的物種的LH序列，魚綱分類到目，具體見表2。這些序列用于同源性比較及進化樹構建。運用Clustal X2進行多重序列比對；系統進化樹構建使用MEGA4.0軟件中Neighbor-joining法（自展值為1 000）。

表1 實驗所用引物及其序列Table 1 Sequencesof the primersused for the PCR analysis

2.7 實時熒光定量PCR檢測m RNA組織及周期表達差異

根據克隆得到的半滑舌鰨LH cDNA的序列，設計并合成引物LHF1和LHR1，同時合成18S F和18SR作為內參引物。對繁殖周期半滑舌鰨表達分析，每個發育階段分別取3條半滑舌鰨，并且每個實驗魚設定3個平行。取半滑舌鰨組織，合成cDNA第一鏈，應用實時定量PCR（qRT-PCR）方法檢測LHmRNA在不同組織及繁殖周期的相對表達量。反應體系參考SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡ（寶生物工程（大連）有限公司）試劑盒說明書，使用2-Step法，反應條件為：95℃預變性30 s，95℃預變性5 s，60℃預變性22 s，共40個循環。

實時熒光定量PCR反應在Eppendorf公司的Mastercycler eprealplex上進行，并收集反應信息。程序運行完成后進行熔解曲線分析以確定引物及反應是否正常。為保證結果的可靠性，進行三次平行試驗。所得數據采用SPSS（13.0）統計進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著。最后依據2-△△Ct方法[15]，制作出mRNA相對表達量的關系圖表。

表2 同源性比較及進化樹中引用的基因序列號Table2 Genbank accession number of genesused for homologue and phylogenesis analysis

2.8 血漿LH繁殖周期濃度測定

實驗用魚同2.1節實驗材料。即在每次取樣時都對半滑舌鰨進行抽血，12 000 r/m in、4℃離心10 min，吸取上清液。血清于-20℃保存備用。采用碘（125I）RIA法測定血漿中LH含量，先制作標準曲線，當相關系數R接近于1時，曲線理想，如圖1所示。然后，每個樣品雙管平行上樣于FJ-2008PSγ放射免疫計數器進行檢測，樣品間再設兩個平行。實驗數據表示為平均數±標準差（Mean±SD），使用SPSS16.0軟件進行顯著性檢驗分析。

圖1 血漿LH測定標準曲線（R=0.999 7）Fig.1 The determination stand and curve of plasma LH（R=0.999 7）

3 結果

3.1 LH序列分析

通過實時熒光定量PCR方法，使用引物LHF和LHR獲得長度為197 bp的保守片段。經RACE反應后克隆測序，將5’-RACE和3’-RACE所得片段與所獲得保守序列拼接得到LH基因cDNA全長，其長度為670 bp，開放閱讀框為477 bp，編碼158個氨基酸，其分子量為18 kD，等電點為5.9；第1到第25個氨基酸為信號肽，成熟肽序列包含12個保守的半胱氨酸殘基（Cys）。且此序列3’端非編碼區含有一個加尾信號AATAAA（見圖2），該序列已提交至GenBank（序列號JQ277934）。圖3為半滑舌鰨LH氨基酸與其他物種的比較。

3.2 LH氨基酸序列比對及同源性分析

圖2 半滑舌鰨LH全長以及推斷的氨基酸序列分析Fig.2 cDNA sequence and putative amino acid sequence of the LH of C.semilaevis

圖3 半滑舌鰨LH氨基酸與其他物種LH氨基酸序列的比較Fig.3 Alignment amino acid of C.semilaevis LH with other species

半滑舌鰨LH成熟肽與鰈形目魚類LH成熟肽的相似性分別為塞內加爾鰨（Solea senegalensis）66%、庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）69%和牙鲆（Paralichthys olivaceus）67%。半滑舌鰨LH成熟肽與鱸形目魚類LH成熟肽的相似性分別為斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）74%、真鯛（Pagrusmajor）74%和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）73%。半滑舌鰨LH成熟肽與鯉形目魚類LH成熟肽的相似性分別為金魚（Carassius auratus）58%和斑馬魚（Danio rerio）54%。

半滑舌鰨的LH成熟肽與其他硬骨魚類和人類的LH進行多序列比對時發現，半滑舌鰨LH氨基酸具有糖蛋白激素保守的12個半胱氨酸殘基。在半滑舌鰨的LH成熟肽的氨基酸序列中，發現了一個N-糖基化位點：19～21 NQT；該糖基化位點在大多數硬骨魚類是保守的。在半滑舌鰨成熟肽序列中存在與其他動物高度保守的特征基序如LH的第4個半胱氨酸殘基位點和第5個半胱氨酸殘基位點之間存在著硬骨魚類特異性的Cys-Ser-Gly-His（CSGH）區域。

3.3 LH系統進化分析

通過MEGA4.0軟件Neighbor-Joining法構建NJ系統進化樹（見圖4），置信度檢驗1 000次，獲得的進化樹表明硬骨魚類LH聚類，親緣關系較近；而與哺乳類和鳥類等親緣關系較遠。不同物種LH氨基酸序列比較發現：半滑舌鰨LH與鰈形目和鱸形目的LH相似性（58%～68%）比鮭形目（48%～50%）、鯉形目（47%～51%）、鰻鱺目（47%）、鲇形目（48%）和高等脊椎動物人類（34%）LH同源性高。但是半滑舌鰨LH與鰈形目中的其他魚類LH同源性相對低（58%～64%），與鱸形目LH同源性較接近（64%～68%）；這可能是導致鰈形目LH不能聚為一簇的原因。

3.4 LHm RNA在不同組織的表達分析

采用實時熒光定量PCR法，檢測LH在半滑舌鰨的腦、垂體、鰓、心、頭腎、腎、肝臟、脾臟、胃、腸、卵巢、肌肉12種組織中的表達。結果如圖5所示，LH在所有組織中都有表達，在垂體相對表達量最高，在腦和卵巢中表達量相對較豐富，分別比垂體低約78 740倍和5 180倍。另外，在鰓、心、頭腎、腎、肝臟、脾臟、胃、腸、肌肉這9個組織中，LH mRNA雖然表達量非常小，但仍可檢測到表達。單因素方差分析結果顯示，LHmRNA在垂體的表達與其他組織中的表達量差異顯著（P＜0.05）。

圖4 基于MEGA4.0中的NJ方法的半滑舌鰨LH與其他物種分子進化樹聚類分析Fig.4 Phylogenetic tree of the LH from C.semilaevis and other vertebrates in M EGA4.0

3.5 半滑舌鰨組織學

對實驗用魚的卵巢進行組織切片和H-E染色，并進行半滑舌鰨卵巢發育分期（見圖6）。Ⅱ期卵巢：幾乎全為Ⅱ時相卵母細胞；胞質嗜堿性，可見數個核仁（見圖6a）。Ⅲ期卵巢：排列緊密，以Ⅲ時相卵母細胞為主，也有Ⅱ時相卵母細胞存在。細胞體積增大，呈規則的橢圓形。胞質嗜堿性，胞核內可見大量核仁（見圖6b）。Ⅳ期卵巢：以Ⅳ時相卵母細胞為主，可見少量Ⅱ時相和Ⅲ時相卵母細胞。體積顯著增加，輻射帶增厚，胞質內卵黃顆粒充滿，偏嗜酸性（見圖6c）。Ⅴ期卵巢：以Ⅴ時相卵母細胞為主，體積繼續增大，胞質中充滿粗大的卵黃顆粒，并逐漸融合成塊狀；細胞核偏位，核膜逐漸模糊（見圖6d）。Ⅵ期卵巢：可見正在退化的卵母細胞，有少數Ⅱ和Ⅲ時相的卵母細胞，放射膜厚，卵黃顆粒、胞核模糊消失，可見閉鎖空泡（見圖6e）。

圖5 半滑舌鰨LHmRNA在不同組織中的表達水平Fig.5 Expression level of LH m RNA in different tissues of C.semilaevis tissues

3.6 LH m RNA在雌性半滑舌鰨繁殖周期的表達模式

采用實時熒光定量PCR方法檢測雌性半滑舌鰨LHmRNA在繁殖周期Ⅱ～Ⅵ期的腦、垂體、卵巢3個組織中的表達水平，表明LHmRNA在Ⅱ～Ⅵ各繁殖周期的腦、垂體、卵巢3個組織都有表達，但表達水平有差異，具體結果見圖7。

圖6 半滑舌鰨卵巢不同發育時期的組織切片Fig.6 The stained sections for each of ovarian development stageof C.semilaevis Günther

圖7 LH m RNA在雌性半滑舌鰨繁殖周期的表達水平Fig.7 Expression level of LHm RNA in reproductive cycles of female C.semilaevis

腦組織中，LH mRNA在Ⅱ～Ⅴ期表達水平下降，Ⅳ期急劇下降，到Ⅴ期時達最低水平，并明顯低于其他發育期水平，Ⅵ期時又有所回升。由SPSS16.0軟件顯著性檢驗分析得出，LH mRNA在各繁殖周期腦組織的表達水平差異顯著（P＜0.05）。垂體組織中，LHmRNA的表達水平在Ⅱ～Ⅴ期穩步上升，Ⅴ期達最高水平，Ⅵ期下降基本與Ⅱ期表達水平相同。顯著性檢驗分析表明，垂體LH mRNA在Ⅱ、Ⅵ發育期的表達處于同一低水平，差異不顯著（P＞0.05），并與Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ發育期的高表達水平差異顯著（P＜0.05）。說明垂體組織的LH在性腺成熟及排卵時期（尤其Ⅴ期）水平高，而卵巢發育前期和排卵后水平較低。卵巢組織中，LHmRNA的表達水平在Ⅱ～Ⅴ期逐漸上升，到Ⅴ期時達最高水平，Ⅵ期急劇下降，達最低值。顯著性檢驗分析表明，卵巢LHmRNA各發育期的表達水平差異顯著（P＜0.05）。推測卵巢LH主要對卵母細胞最終成熟及卵子排出的卵巢起作用，Ⅴ期卵巢已完全成熟；Ⅵ期卵巢退化，此時卵巢除含有很多退化的卵母細胞外，一部分卵母細胞退化至Ⅱ、Ⅳ時相，此時卵巢LH發揮相對較弱的生理作用。

3.7 血清LH在雌性半滑舌鰨繁殖周期的變化規律

雌性半滑舌鰨繁殖周期血清LH濃度變化呈現明顯的周期性變化規律，即呈先上升后下降的趨勢。Ⅱ期時濃度最低，均值為3.24m IU/m L；之后上升，Ⅴ期時達到最大濃度，均值為4.80m IU/m L，說明LH在卵巢發育至Ⅴ期（即卵母細胞成熟及排卵）時發揮最大作用，LH主要參與卵子的成熟及排放過程；Ⅵ期濃度明顯下降（P＜0.05），均值只有3.55 m IU/m L，說明卵母細胞退化時LH作用有所減弱；但濃度高于Ⅱ期，此時卵巢內存在退化的Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ時相卵母細胞（見圖8）。

圖8 雌性半滑舌鰨繁殖周期血漿LH的濃度Fig.8 Concentration of plasma LH in reproductive cycles of female C.semilaevis

雌性半滑舌鰨繁殖周期，采用碘（125I）RIA法測定血漿LH變化規律與實時熒光定量PCR方法檢測到的LHmRNA水平在垂體及卵巢組織的變化規律基本一致。

4 討論

4.1 半滑舌鰨LH基因克隆及序列分析

本實驗克隆了半滑舌鰨LH cDNA的全長序列，并對半滑舌鰨的LH與其他脊椎動物氨基酸序列的同源性進行比較，結果顯示半滑舌鰨LH同鰈形目、鱸形目的LH相似性較高，而同哺乳動物LH的相似性相對低。半滑舌鰨LH成熟肽序列包含12個半胱氨酸殘基Cys，與所比對的各物種中完全保守（見圖4），并與GTHα亞基交聯形成二硫鍵，參與蛋白折疊及配體受體相互作用[16]，因此，硬骨魚類LH結構的變化會影響到與受體結合能力及異源二聚體的穩定性。四足類及硬骨魚類的LHβ存在與GTHα結合相關的某些重要的氨基酸殘基，比如一些硬骨魚類第4個和第5個Cys位點之間就存在著特異性的Cys-Ser-Gly-His（CSGH）區域[17]，半滑舌鰨的這一結構（見圖4）也能反映LH在進化中高度的保守性。另有研究發現，鰨目魚LH多肽一級結構有一個N-糖基化位點，與其他硬骨魚類和高等脊椎動物保持高度保守性，這一結構可能與有機體的生物合成及激素調控有關[18]。本研究發現半滑舌鰨LH也有1個N-糖基化位點Asn（19～21 NQT）（見圖4），具體生理機能有待進一步探究。依據Neighbor-Joining方法構建系統進化樹，發現半滑舌鰨LH與鰈形目中的其他魚類LH同源性（58%～64%）比鱸形目（64%～68%）相對較低，這可能是導致鰈形目LH不能聚為一簇的原因。

4.2 LH基因在繁殖季節半滑舌鰨的組織表達

利用實時熒光定量PCR方法檢測LH基因在半滑舌鰨各組織的表達，結果發現：所有組織中均有表達，垂體表達量最豐富，其他組織表達量都很小，腦和性腺相對表達量較高。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）[19]、金頭鯛（Sparusaurata）[20]和斑馬魚（Danio rerio）[21]的研究中，利用半定量實時PCR方法和免疫細胞化學檢測方法，檢測到LHmRNA在非垂體組織中亦有表達，與本研究結果相似。但有關LH mRNA在非垂體組織中廣泛表達的生理機制尚未明確，推測半滑舌鰨LH可能具有更加廣泛的垂體外的生理功能，對此進行深入研究具有重要意義。

4.3 雌性半滑舌鰨LHmRNA周期表達模式分析

本研究表明半滑舌鰨卵巢發育至Ⅱ期，LH mRNA表達量相對低，之后mRNA水平逐漸穩步上升；直到Ⅳ～Ⅴ期mRNA表達量急劇增大。說明LH主要促進卵母細胞最終成熟及排卵。有研究利用原位雜交、放射免疫、Northern blot、實時熒光定量PCR等方法，檢測虹鱒魚[22～24]、許氏平鲉（Sebastes schlegeli）[25]、斑點叉尾鮰[26]的LH，發現卵巢最終成熟及排卵時LHmRNA水平急劇上升，并起主導作用。與本實驗結果一致。

各時期LH不同的表達水平可能與其受體時空表達的差異性相關。斑點叉尾鮰的研究表明，垂體LH水平同卵巢LHR水平的變化規律基本一致，推測LH與其受體結合具有高度的特異性。但陳曉燕[27]對半滑舌鰨LHRmRNA進行相關研究，顯示LHR在Ⅲ期卵巢和腦中表達量最豐富，與本研究結果有所不同。因此，半滑舌鰨LH與其受體結合的高度特異性有待進一步研究。

4.4 雌性半滑舌鰨血清LH周期變化及其與LH基因表達關系

實驗采用RIA方法，檢測半滑舌鰨血清LH在卵母細胞生長、卵黃生成、卵子成熟及排卵等各時期的表達水平。結果顯示：性腺發育早期（即卵黃生成作用），血清LH濃度逐漸穩步上升，直到排卵時（Ⅴ期卵巢）濃度最大。揭示卵黃生成階段垂體內LH大量合成并積累，從而排卵時血清LH濃度達到最高。由此可見，半滑舌鰨血清LH激素分泌的變化規律與卵巢發育、卵母細胞生長、成熟及退化基本一致，在卵子成熟及排卵時期起主導作用。這與早期虹鱒的研究結果相一致。虹鱒LH垂體合成及其血清濃度不同步，LHmRNA先在垂體合成，之后LH激素進入血液循環[28]，發揮相應生理學作用。本研究同時發現，雌性半滑舌鰨繁殖周期，血漿LH濃度的變化規律同LHmRNA水平在垂體及卵巢組織的變化規律基本一致。但對于半滑舌鰨LH垂體合成及血漿濃度是否同步，應進一步進行科學實驗研究。

GtH的合成及釋放受各種因素制約，其中性類固醇激素作用最大。許多研究表明，虹鱒[29]、歐洲鰻鱺[30]及銀大馬哈魚[31]血清LH的含量及mRNA水平與性類固醇激素有關。在血清FSH及E2[32]水平已達最高值的卵黃生成后期，LH濃度才急劇上升，說明雌激素能刺激LH垂體內合成，從而血漿LH濃度增大。半滑舌鰨GtH的合成釋放與性類固醇激素的相互作用關系有待進一步研究證實。

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