性病高危人群陰道乳酸桿菌的調查研究

王 聰，白 麗*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000）

性病高危人群陰道乳酸桿菌的調查研究

王 聰1，2，白 麗1，2*

（1.大理學院基礎醫學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000）

目的：比較HIV性途徑感染女性高危人群及健康體檢人群陰道乳酸桿菌的檢出率及具有防御功能的乳酸桿菌檢出率，對高危組陰道防御能力做出正確評估，為更好地實施預防治療及干預活動提供理論基礎。方法：選擇71例健康體檢者，120例性工作者陰道分泌物進行乳酸桿菌陽性率及具有防御功能的乳酸桿菌陽性率檢測，確定高危人群組乳酸桿菌分布及防御能力。結果：高危人群組乳酸桿菌的檢出率及具有防御能力的乳酸桿菌檢出率均低于健康人群，經χ2檢驗，差異有統計學意義。結論：性病的易感性與陰道的微環境的破壞，尤其乳酸桿菌數量的減少及防御能力的降低有著至關重要的關系。

性傳播疾??；高危人群；乳酸桿菌

性傳播疾?。╯exually transmitted disease，STD），是通過感染者經性接觸傳播給未感染者，有20余種，包括至今仍無有效療法的致死性傳染病AIDS，性工作者是其傳播的主要橋梁〔1-2〕。性病病原體存在于感染者的生殖道分泌物中，性接觸時病原體可通過破損處侵入血液而感染，如陰道內存在抑制性病病原體活性的因素可能會減少性病的感染及傳播，這種因素存在與否由陰道的防御系統決定的〔3-5〕。陰道防御系統是由陰道內微生態菌群、陰道免疫系統及黏膜共同組成，其中陰道內微生態的平衡在防御過程中起了主要作用。研究發現健康婦女陰道正常菌群中以乳酸桿菌（Lactobacillus）占主導地位，是最重要的優勢菌。其可通過產酸、H2O2、細菌素等抗微生物物質來抑制陰道病原微生物的入侵，維持陰道微生態平衡、抵抗性病及生殖道感染〔6-8〕。為了了解性病高危人群陰道防御情況，我們對其陰道乳酸桿菌的有無及功能進行調查?，F將結果報道如下。

1 材料

1.1 試驗材料 菌株：金黃色葡萄球菌標準菌株，大腸埃希菌標準菌株，銅綠假單胞菌，乳酸桿菌臨床分離株。細胞株：Hela細胞。

1.2 儀器設備及試劑 恒溫培養箱、厭氧培養系統、pH檢測儀、CO2培養箱、MH培養基、MRS培養基、細胞培養液等。

2 方法

2.1 乳酸桿菌檢出率 分別取性病高危人群及健康體檢者陰道分泌物，用涂布法分離出分泌物中的細菌，對不同菌落進行革蘭染色并鏡檢，根據菌落及鏡下形態將疑似乳酸桿菌接種于乳酸桿菌選擇培養基MRS培養基，生長者為乳酸桿菌。

2.2 乳酸桿菌功能的檢測

2.2.1 產酸功能檢測 將乳酸桿菌接種于pH值為7的MRS培養基，厭氧培養48 h，通過pH測試儀檢測上清液的pH值，了解乳酸桿菌的產酸情況。

2.2.2 產H2O2功能的檢測 將乳酸桿菌分區接種于含有一定量TMB（3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺）-HRP（辣根過氧化物酶）的MRS平板上，37℃厭氧培養48 h，置于有氧環境中30 min后觀察顏色變化。產H2O2的乳酸桿菌菌落可在有氧存在的情況下，被培養基中的HRP催化，與底物TMB發生反應，呈現藍色。

2.2.3 黏附功能的檢測 首先復蘇、轉接及處理黏附用細胞（Hela細胞）。將乳酸桿菌用PBS洗滌3遍（8 000 r/min，10 min）。用無抗生素和小牛血清的RPMI-1640細胞培養液調整細菌濃度為5×108個/mL。在細胞培養板每孔中放置一片蓋玻片，向細胞培養板中每孔加入1 mL上述RPMI-1640細胞培養液，再加入1 mL乳酸桿菌懸浮液。輕柔晃動細胞培養板，使乳酸桿菌分散均勻，置于37℃，5%CO2培養箱中培養2.5 h。取出蓋玻片，并用PBS洗滌3遍，自然干燥后瑞士染色，油鏡下觀察細菌在Hela細胞上的黏附情況。

2.2.4 拮抗功能的檢測 用雙層平板法對乳酸桿菌抑制病原菌（本實驗選用金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌及銅綠假單胞菌3種病原菌的標準菌株）的能力進行篩選。用生理鹽水懸浮菌體并調整細菌濃度為6×108個/mL，點種于薄MRS固體培養基，厭氧培養，37℃培養1 h。用標準比濁管進行比濁，制備0.5麥氏單位濃度的致病菌懸液。按菌液：MH半固體瓊脂培養基=1∶9的比例在40℃進行充分混合，將約10 mL混合液倒入培養，使其均勻分布，37℃培養12 h后觀察結果。

2.3 統計學分析 采用EXCEL軟件和SPSS17.0統計軟件進行數據的分析處理。

3 結果

3.1 兩組人群乳酸桿菌檢出率 性病高危人群組乳酸桿菌陽性率為22.5%，健康對照組乳酸桿菌陽性率76.1%，經χ2檢驗P＜0.05，差異有統計學意義。見表1。

表1 兩組人群陰道乳酸桿菌陽性率比較

3.2 兩組人群乳酸桿菌產酸能力的比較 性病高危人群組乳酸桿菌培養上清液pH值中位數高于健康對照組，經秩和檢驗P=0.000＜0.05，差異有統計學意義。性病高危組上清液pH≤4.6占0%，pH＞5的占77.8%，介于兩者之間的占22.2%。健康陰道pH≤4.6占50%，pH＞5占22.2%，介于兩者之間的占27.8%。顯示高危組乳酸桿菌培養上清液pH值高于健康組，經卡方檢驗P＜0.05，差異有統計學意義。產酸乳酸桿菌的減少進一步加重了高危人群陰道微環境被破壞。見表2。

3.3 兩組人群乳酸桿菌產H2O2能力比較 性病高危人群組產H2O2乳酸桿菌檢測率為40.7%，健康對照組產H2O2乳酸桿菌檢測率為77.8%，經χ2檢驗P＜0.05，差異有統計學意義?？梢姼呶＝M產H2O2乳酸桿菌檢測率明顯低于健康組。見表3。

3.4 兩組人群乳酸桿菌黏附能力比較 性病高危人群組具有黏附功能的乳酸桿菌檢測率為29.6%，健康對照組具有黏附功能的乳酸桿菌檢測率為85.2%，經χ2檢驗P＜0.05，差異有統計學意義?？梢姼呶＝M具有黏附功能的乳酸桿菌檢測率明顯低于健康組。見表4。

表2 兩組人群乳酸桿菌產酸功能比較

表3 兩組人群陰道乳酸桿菌產H2O2功能比較

表4 兩組人群陰道乳酸桿菌黏附能力比較

3.5 兩組人群乳酸桿菌拮抗能力比較 性病高危人群組對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌有拮抗作用的乳酸桿菌檢出率分別為63%、44.4%、55.6%。健康對照組對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌有拮抗作用的乳酸桿菌檢出率分別為88.9%、83.3%、85.2%。經χ2檢驗P＜0.05，差異有統計學意義。分別對兩組人群分離的乳酸桿菌拮抗3種病原菌能力進行兩兩比較，P＞0.05，差異無統計學意義?？梢姼呶＝M具有黏附功能的乳酸桿菌檢測率明顯低于健康組，而乳酸桿菌對病原菌的拮抗能力差異無統計學意義。見表5-7。

4 討論

乳酸桿菌是健康婦女陰道內最重要的優勢菌屬，乳酸桿菌數量減少甚至缺失是陰道微生態失衡的重要標志之一，隨之而來的是陰道炎癥及性病的發生率增加。性病高危組陰道乳酸桿菌檢出率明顯低于健康組，可見乳酸桿菌的缺失是此組人群易患性病及生殖道炎癥的重要原因之一。乳酸桿菌主要就是通過它的黏附、產酸、產H2O2及拮抗作用對陰道進行保護，其功能的好壞直接影響陰道防御能力的高低。本實驗通過檢測這些功能，以判斷性病高危組的陰道防御功能。本實驗通過Hela細胞模型（Hela細胞是陰道宮頸癌細胞，與陰道上皮細胞（VEC）具有較高的同源性，其表面抗體及組成與VEC具有較大的相似性，可以基本反映細菌對于VEC的黏附情況）。對陰道源乳酸桿菌的黏附效果進行了篩選。性病高危組中具有黏附能力乳酸桿菌檢出率為29.6%明顯低于對照組85.2%，經檢驗差異有統計學意義。而致病菌感染陰道的首先步驟是入侵黏膜系統，有良好黏附能力的乳酸桿菌的黏附作用在該過程中起到了重要的防御作用，當病原菌入侵時，乳酸桿菌首先和病原菌競爭VEC表面的受體，取代病原菌與受體結合，阻止病原菌的初始黏附。隨后和這些病原菌發生凝集反應，再通過產生酸、H2O2或細菌素樣等殺菌物質來殺滅病原菌。本實驗對兩種人群陰道乳酸桿菌產生以上殺菌物質的能力進行了調查。發現高危組人群陰道乳酸桿菌產酸能力明顯低于對照組。有研究表明大多數病原菌甚至HIV對酸較敏感，乳酸桿菌可以通過分解乳酸降低陰道酸堿度，抑制殺傷病原菌，減少性病的發生〔9-11〕。同時研究發現高危組陰道產H2O2的乳酸桿菌陽性率40.7%明顯低于對照組77.8%。而乳酸桿菌產生的H2O2可形成超氧化陰離子形成破壞性氫氧游離基（·OH），對病原菌的細胞壁的進行強氧化作用及破壞核酸及細胞內蛋白質，從而殺傷病原菌。有研究發現乳酸桿菌產生的H2O2對引起泌尿生殖道的感染的病原菌如加得納菌、淋球菌、念珠菌等有重要的抵抗作用〔12〕。此外乳酸桿菌還可以通過在代謝過程中產生的一些抑菌活性的物質如細菌素，抑制及殺傷病原菌，保護陰道微環境，降低性病的感染及傳播。而本實驗中高危人群抑制和殺傷病原菌的能力明顯低于對照組，說明高危人群陰道乳酸桿菌可產生抑菌物質的能力較低，陰道的防御能力也較低。

表5 兩組人群乳酸桿菌拮抗功能比較

表6 高危組乳酸桿菌對3種細菌拮抗功能比較

表7 健康組乳酸桿菌對3種細菌拮抗功能比較

乳酸桿菌通過以上的一種或者幾種機制來對致病菌起到拮抗作用。從實驗的結果可以看出，性病高危組具有黏附、產酸、產H2O2、產抑菌物質功能的乳酸桿菌檢出率明顯低于健康組，高危組陰道的防御功能明顯低于健康組，應進行相應的預防。而防御功能較好的乳酸桿菌菌株類型生長特性、抑菌作用以及抗菌譜和體內抗菌效果還有待于進一步研究。

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*通訊作者：白麗，教授，博士.

（責任編輯 李 楊）

Primary Study on Lactobacillus from vaginal of High-risk Females in STD

WANG Cong1，2，BAI Li1，2*
（1.Pre-Clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective：To compare the quantity and the protection function of Lactobacillus in the vagina between the high-risk females in STD and the healthy group，and evaluate its defense capability，in order to provide a theoretical basis for implementing the prevention and treatment interventions.Methods：71 healthy women and 120 high-risk females in STD were selected.The rate of vaginal Lactobacilli and its function of producing the organic acids，hydrogen peroxide（H2O2），and other antimicrobial substances in vaginal secretions were detected to quantify the number and defensive ability of Lactobacilli of high risk population.Results：The positive rate of Lactobacillus，and the protection of the high-risk females in STD were lower than the healthy group.Conclusion：Susceptibility of STD has an important relationship with the damage of the micro environment of vaginal，especially the reduction of the amount and defense ability of Lactobacillus

STD；high risk group；Lactobacillus

R512.91

A

1672-2345（2014）04-0018-04

10.3969/j.issn.1672-2345.2014.04.006

“十一五”國家傳染病重大專項資助項目（2008ZX10001-015）；大理學院青年教師科研基金資助項目（KYQN201109）

2013-12-22

2014-01-03

王聰，助理實驗師，主要從事感染與免疫學研究.