TGF-β1、Caspase-3和WT1在腎活檢腎小球腎炎組織中的表達及臨床病理意義

張 弢，張 雨，李小麗，何敏華

（大理學院附屬醫院，云南大理 671000）

TGF-β1、Caspase-3和WT1在腎活檢腎小球腎炎組織中的表達及臨床病理意義

張 弢，張 雨，李小麗，何敏華*

（大理學院附屬醫院，云南大理 671000）

目的：探討轉化生長因子β1（TGF-β1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）及腎母細胞瘤抑癌基因蛋白（WT1）在腎活檢腎小球腎炎組織中的表達及其意義。方法：采用Envision法對40例腎小球腎炎組織及7例對照組腎組織進行TGF-β1、Caspase-3和WT1免疫組織化學染色標記、分析。結果：TGF-β1、Caspase-3、WT1在各種腎炎組織中均有表達，各實驗組與對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。TGF-β1在系膜增生性腎小球腎炎組的表達明顯低于膜性腎病組（t=-4.131，P=0.002）；Caspase-3在各組別中其表達差異無統計學意義；WT1在大量高蛋白尿組表達低于非大量蛋白尿組（t=-2.130，P=0.046）；其余組別差異無統計學意義。WT1的低表達與TGF-β1、Caspase-3的高表達相關。結論：TGF-β1、Caspase-3表達的上調及WT1表達的下調與腎病理改變密切相關，蛋白尿和足細胞減少可能是腎臟病進展的預測因子及腎小球硬化的原因。

腎活檢；轉化生長因子β1；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；腎母細胞瘤基因蛋白；蛋白尿；免疫組織化學

終末期腎臟?。╡nd-stage renal disease，ESRD）是各種逐漸進展腎臟病和腎損害的最終環節，病程中囊括了龐大的臨床癥群，其死亡率和發病率在全世界范圍內不斷攀升，對醫療保險系統帶來嚴重沖擊〔1-2〕。在我國腎小球腎炎是導致終末期腎病最常見的原因〔2〕，腎穿刺活組織檢查（簡稱腎活檢）正是確定腎臟疾病診斷、治療及預后評估的重要手段。隨著近年來分子病理學技術在腎臟病理學的滲透，對腎臟疾病的病因、發病機制等提供重要信息。研究〔3〕表明轉化生長因子β1（TGF-β1）參與腎血管疾病進展，炎癥細胞浸潤，腎小球硬化及腎間質纖維化。半氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）是細胞凋亡的關鍵執行者，動物實驗〔4〕表明其表達水平與各種腎小球、腎小管及腎間質細胞的凋亡、炎癥、纖維化密切相關；腎母細胞瘤抑癌基因蛋白（WT1）的表達減少反映了足細胞數量的減少及腎小球濾過屏障的受損，導致了疾病進展及腎小球的硬化〔5〕。本實驗旨在對腎活檢患者TGF-β1、Caspase-3、WT1表達水平的檢測和分析，探討處于發展早期的腎小球疾病損傷機制與病理類型及臨床表現的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 標本來源 選取大理學院附屬醫院腎內科2010年3月至2013年3月期間資料完整，符合腎活檢適應癥〔6〕137-139，且為首次腎活檢患者的腎組織標本，共40例，男性22例，女18例，年齡15~65歲，中位年齡40歲。病理診斷為22例系膜增生性腎小球腎炎（其中7例為IgA腎病，15例非IgA腎?。?，13例膜性腎病，2例微小病變型腎病，1例局灶節段性腎小球硬化，1例狼瘡性腎炎，1例糖尿病腎病。并收集患者首次腎活檢時年齡、性別、病程、血肌酐（SCr）、24小時尿蛋白定量值（TUpr）、血漿白蛋白值（Alb）。對照組選取自腎腫瘤及多囊腎患者遠離腫瘤及多囊腎囊壁部分的腎組織。

1.1.2 研究分組 病理分組：病理診斷類型分組：40例腎活檢患者分為系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）組及膜性腎?。∕N）組。腎小球濾過率（GFR）分組：采用MDRD公式計算評估所有患者GFR水平，分為腎損害組和非腎損害組。蛋白尿分組：根據TUpr標準分為大量蛋白尿組和非大量蛋白尿組。見表1。

1.2 主要試劑 TGF-β1兔抗人多克隆抗體（ab53169），工作濃度1∶200，Caspase-3兔抗人多克隆抗體（ab4053），工作濃度1∶700，均購自美國abcam公司；WT1鼠抗人單克隆抗體（克隆號6F-H2），工作濃度1∶100，購自丹麥Dako公司；二抗為通用型Envision套盒（K500711），DAB試劑盒（K346711）均購自于基因科技（上海）有限公司。

表1 不同分組的一般臨床資料

1.3 方法及結果判定 采用免疫組化Envision二步法檢測，實驗步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行。TGF-β1、Caspase-3陽性表達位于細胞膜和細胞質，WT1陽性表達位于細胞核，均表現為棕黃色或黃色顆粒。每張切片在高倍鏡下（400倍）隨機選取5個視野，將圖像采集入計算機，應用Image-Pro Plus（IPP）6.0彩色圖像處理系統半定量分析測定感興趣區域〔7〕TGF-β1、Caspase-3、WT1的積分光密度（IOD），取平均值反映標本相關指標的表達量。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，參數以均數±標準差）表示，計量資料采用t檢驗，計數資料采用Fisher’s精確檢驗，多因素影響分析采用多重線性回歸分析（Backward法）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同分組首次腎活檢患者病理類型、臨床資料情況比較 采用兩獨立樣本t檢驗對40例首次腎活檢患者年齡、性別、病程在所有研究分組中顯示差異無統計學意義（P＞0.05）。病理分組與GFR分組中TUpr值、Alb值差異無統計學意義（P＞0.05）；病理類型分組與尿蛋白分組中GFR值差異無統計學意義（P＞0.05）；GFR分組和尿蛋白分組中病理類型（MsPGN vs MN）予Fisher’s精確檢驗，結果顯示差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 TGF-β1、Caspase-3、WT1在不同組別及對照組的表達 TGF-β1、Caspase-3、WT1在所有腎組織標本中均有表達，TGF-β1、Caspase-3主要表達在腎小球和腎小管細胞的胞膜和胞質，染色較強且均一，少量表達在腎小管腔內，染色均一性差。WT1則僅表達在腎小球上皮細胞的細胞核，染色較深。

40例病例組與7例對照組在TGF-β1、Caspase-3、WT1的表達（IOD值，下同）差異均有統計學意義（t= 6.256，P=0.000；t=4.744，P=0.000；t=-3.05，P=0.022）。TGF-β1的表達：MsPGN組＜MN組（t=-4.131，P= 0.002）；其余分組差異無統計學意義。Caspase-3的表達在3個分組中差異無統計學意義。WT1的表達：大量蛋白尿組＜非蛋白尿組（t=-2.130，P=0.046）；其余分組差異無統計學意義。見表2及封三圖1。

表2 TGF-β1、Caspase-3、WT1在不同分組及正常對照組的表達

采用多重線性回歸（Backward法）對TGF-β1、Caspase-3、WT1的表達強度和相關臨床資料建立多重線性回歸方程（數據資料均經過標準化處理）。y^1=2.393×10-16-0.373X1-0.317X2+0.245X3+0.163X4（y1：TGF-β1IOD值；X1：TUpr值；X2：WT1 IOD值；X3：病理類型；X4：Caspase-3 IOD值）；y^2=-6.883×10-17-0.387X1-0.325X2-0.290X3+0.160X4-0.086X5+ 0.058X6-0.023X7（y2：WT1IOD值；X1：年齡；X2：TUpr值；X3：TGF-β1IOD值；X4：Alb值；X5：GFR值；X6：性別；X7：Caspase-3 IOD值）。Caspase-3未能建立回歸方程（P＞0.05）。結果顯示TUpr值對TGF-β1和Caspase-3的表達作用明顯；TGF-β1和WT1表達水平互為負相關影響因素，后者對前者表達影響更大；Caspase-3表達對兩者有影響但較弱；年齡、性別、TUpr值、GFR值、Alb值這些臨床指標對WT1更易造成影響。

3 討論

ESRD患者在我國逐年增長，已成為常見的高患病率及致死率疾病。腎活檢已成為多數大型醫院的常規檢查項目，其技術及診斷水平不斷發展，但是仍沒有一種令人滿意的腎小球疾病分類法〔6〕276可以將病因、發病機制、組織形態學改變到臨床綜合征一一對應，且能指導治療。本研究中相關分組的資料對比的差異多無統計學意義即印證了上述觀點。

本研究發現TGF-β1在13例膜性腎病的表達（2.784±1.068）高于22例系膜增生性腎小球腎炎（1.099±0.488），且兩者均高于正常對照組（0.342± 0.242）。提示TGF-β1表達可能與病理類型相關。相關研究鮮見報道，僅早年Iwano M等〔8〕發現與正常腎組織相比，TGF-β1表達差異由大至小依次為糖尿病腎病、中度系膜增生性腎小球腎炎及狼瘡性腎炎，提示系膜基質增多的病理改變與TGF-β1表達有關。TGF-β1作為重要調節因子能引起腎組織結構改變，其誘導了足細胞減少、系膜增寬、細胞外基質合成，內皮細胞間質樣轉變致腎小球硬化；腎小管纖維化增生致小管細胞缺失及間質纖維化〔3〕。

Caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行者〔4〕，本研究中雖然其在病例組的表達顯著高于對照組，但不乏輕度病理改變的個例表達水平與對照組持平甚至更低，且研究分組中未顯示表達差異。王晨靜等〔9〕發現Caspase-3在IgA腎?、窦墸℉aas分級）的表達顯著低于IgA腎?、騸Ⅴ級，且在IgA腎?、騸Ⅴ級中表達無差異；而Bcl-2的表達在IgA腎?、髜Ⅴ級明顯高于IgA腎?、駘Ⅱ級，Bcl-2的表達的增強抑制Caspase-3在較高分級IgA腎病的表達。Yang B等〔10〕在動物實驗中也闡明Caspase-3的表達受Bax/Bcl-2平衡影響。這些提示Caspase-3在腎臟病進程早期受到多因素的調節，細胞凋亡和增殖在病程早期能維持平衡。

足細胞是近年來腎臟病研究的熱點，本研究發現其標志物WT1僅表達在腎小球上皮細胞的細胞核，正常組的表達顯著高于病例組，在蛋白尿分組中非大量蛋白尿組的表達（2.818±1.162）高于大量蛋白尿組（1.860±0.896），推測足細胞損傷可能引起WT1表達降低，而尿蛋白既是足細胞損傷的臨床表現又同時扮演了損傷因素的角色。Schumacher VA等〔11〕研究提示WT1在腎小球濾過屏障的維持中起核心作用，并在足細胞與內皮細胞之間起到交互調節作用，缺乏濾過屏障而導致的難治性的大量蛋白尿將引起ESRD。Peired A等〔11-12〕在動物模型中發現蛋白尿阻止了腎祖細胞向足細胞的分化，而視黃酸具有保護作用，血漿白蛋白是其載體，提示蛋白尿與足細胞損傷并不是簡單的劑量依賴關系，它不僅是病程發展的標準物也是腎小球硬化的原因。

在多重線性回歸模型中我們發現TUpr值對TGF-β1和WT1的表達幾乎占首要地位，提示蛋白尿可能是慢性腎臟?。–KD）進展的重要影響因素。Gorriz JL等〔13〕認為蛋白尿在CKD進展中是最精確的腎病結局及死亡率的預測因子。本研究提示TGF-β1和WT1表達呈負相關。研究〔5，14〕證實兩者有互相抑制調節的作用而TGF-β1體內試驗致足細胞凋亡率低〔3〕，使我們大膽推測WT1對TGF-β1表達抑制作用更為明顯，而TGF-β1對足細胞損傷的作用途徑更廣泛。Rule AD等〔15〕發現在健康人群的中年齡與腎小球硬化有顯著相關性，年齡相關的腎小球硬化有獨特的腎臟病理學改變，且與其它導致腎小球硬化因素（CKD危險因素、尿蛋白、GFR水平）無相關性。該結論與本研究相關結果存在一致性且互為補充。

Tun?demir M等〔4〕發現足細胞數量的減少是疾病早期的表現，其導致了蛋白尿、腎小球基質的增多、系膜細胞增生、GBM膜增厚、腎小球上皮細胞的凋亡等腎小球損傷，體現在TGF-β1、Caspase-3高表達與WT1低表達。這與本研究在相同指標的表達相吻合。Tun?demir M等研究還提出血管緊張素Ⅱ會促進腎小球上皮細胞的凋亡，并發現厄貝沙坦治療干預后的動物實驗組WT1表達的上調，Caspase-3和TGF-β1表達下調。所以，AT1受體拮抗劑（ARB）或血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）對TGF-β1、Caspase-3、WT1的表達的影響說明其產生腎臟保護作用的分子機制是多途徑的，例如抑制了腎小球上皮細胞的凋亡，減少腎小球基質的產生，維持足細胞數量及腎小球濾過屏障功能等。臨床中存在ARB和ACEI類藥物是降壓藥的主體印象，其減少蛋白尿原因也是對腎血液流變學的影響即降低腎小球內壓。認為此類藥對癥是基本，如患者存在蛋白尿且合并高血壓才是最佳適應征。而減少腎小球腎炎患者的蛋白尿臨床醫生仍多寄希望于糖皮質激素和免疫抑制劑的應用。通過本研究和上述動物實驗的結論ARB和ACEI類藥物臨床應用價值明顯且更廣泛，尤其是在慢性腎小球腎炎疾病的早期應作為首選的基礎藥物。

總之，在腎小球組織病理改變與TGF-β1、Caspase-3、WT1的表達有關。TGF-β1、Caspase-3在顯著病理改變的腎小球疾病中表達增高而WT1表達下降。WT1與TGF-β1表達互相抑制。重要指標尿蛋白和足細胞損傷標志物WT1可能是腎小球疾病的始動及預測因子。TGF-β1、Caspase-3、WT1對發展至ESRD的早期腎小球疾病可能起協同作用。以首次腎活檢時間作為橫斷面，對三者表達水平的研究，對大量臨床有腎活檢適應癥的患者診斷及治療提供新的思路。

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*通信作者：何敏華，教授.

（責任編輯 董 杰）

Expressions and Clinical-pathological Significance of TGF-β1，Caspase-3 and WT1 in Glomerulonephritis

ZHANG Tao，ZHANG Yu，LI Xiaoli，HE Minhua*
（Affiliated Hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective：To explore the expression and significance of transforming growth factor-β1（TGF-β1），cysteinyl aspartate specific proteinase-3（Caspase-3）and Wilms'tumor suppressor gene 1（WT1）in renal biopsy tissues of glomerulonephritis.Methods：40 cases of renal biopsy tissues and 7 cases of control renal tissues were detected and analyzed by Envision immunohistochemistry.Results：TGF-β1，Caspase-3 and WT1 expressed in all cases of renal tissues.There were significant differences between each trail grouping and normal control group（P<0.05）.The positive retes of TGF-β1in group of mesangial proliferative glomerulonephritis were lower than membranous nephropathy（t=-4.131，P=0.002）.Expression of Caspase-3 showed no differences in divided groups.The expression of WT1 in group of massive proteinuria were lower than that non-massive proteinuria（t=-2.130，P=0.046）.Other designed groups have no significant difference.Meanwhile，higher WT1 expression showed the correlation with lower expression of TGF-β1and Caspase-3.Conclusion：Up-regulated expression of TGF-β1and Caspase-3 and down-regulated expression of WT1 were closely related to pathologic change in kidney.Proteinuria and podcytes loss is probably the predictor of renal disease progression and a cause for glomerulosclerosis.

renal biopsy；TGF-β1；Caspase-3；WT1；proteinuria；immunohistochemistry

R446.8

A

1672-2345（2014）04-0025-05

10.3969/j.issn.1672-2345.2014.04.008

2013-10-11

2014-01-06

張弢，碩士研究生，主要從事腎臟病及風濕免疫病研究.