荷斯坦奶牛脊椎畸形綜合征焦磷酸測序檢測方法建立與應用

（山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002）

荷斯坦奶牛脊椎畸形綜合征焦磷酸測序檢測方法建立與應用

王 群 ，孫 濤，鄭小龍，張曉文，姜 帆，趙玉然

（山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002）

為建立一種快速高通量的荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征（complex vertebral malformation，CVM）的分子檢測方法，根據CVM是由于SLC35A3基因第4外顯子559位處發生G→T突變的遺傳學基礎，利用Assay Design SW軟件設計了1對PCR引物和1條測序引物對三種不同基因型的基因材料進行測序分析，建立焦磷酸測序檢測方法。對55份進境荷斯坦奶牛血樣進行檢測，發現有1例為隱性基因攜帶者，將PCR產物進行測序，其DNA序列與焦磷酸測序檢測結果一致。研究表明該方法是一種有效的新方法，可用于荷斯坦奶牛脊椎畸形綜合征的檢測。

脊椎畸形綜合征；焦磷酸測序；荷斯坦奶牛

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒。未突變純合子（A/A）基因材料為構建的含有部分SLC35A3基因質粒pMD-SLC35A3；CVM純合子（a/a）基因材料為人工致突后質粒pMD-CVM；CVM攜帶者（A/a）基因材料為pMD-SLC35A3與pMD-CVM兩者等比混合物。所有質粒均由本實驗室保存。

1.1.2 樣品采集。從2011—2012年山東口岸由澳大利亞進境的荷斯坦奶牛血樣中隨機抽取55份全血樣品，于-20℃保存。

1.1.3 試劑和儀器設備。DNeasy Blood & Tissue Kit、Taq PCR Master Mix Kit、PyroMark Gold Q96 SQA Reagents（1×96）購自Qiagen公司；鏈霉親和素包被磁珠購自GE Health-care BioScience AB公司；硅膠膜型質粒DNA小量提取試劑盒、DNA Marker DL2000購自大連寶生物有限公司；其它常規化學試劑購自北京化學試劑公司。

Sigma1-15普通離心機，Sigma公司產品；Mini-SUB凝膠電泳裝置，Bio-Rad公司；Gel-Doc2000凝膠成像分析系統，Bio-Rad公司產品；PYROMARK ID定量遺傳分析系統，Qiagen公司產品。

1.2 方法

1.2.1 相關基因的生物信息學分析及測序引物的設計。查詢Genbank中登錄號AY160683的牛SLC35A3全基因序列，根據CVM致病的遺傳學基礎，將致病的位點第4外顯子559位處堿基作為目的核苷酸序列，通過 Assay Design SW 軟件設計PCR擴增引物和測序引物。表1中目的核苷酸序列中斜線兩側的黑體堿基表示同位點堿基可能突變情況。

表1引物序列

1.2.2 涵蓋突變核苷酸位點的基因片段的PCR擴增。分別以A/A、a/a和A/a基因材料為模板進行PCR擴增。反應體系為：2×PCR Mix 25μL，上、下游擴增引物（ 20 pmol/L）各2μL，模板 DNA 0.5μL，雙蒸水補足體積至50μL。

PCR 反應條件：94℃預變性5 min； 94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 30s，50個循環；72℃延伸10 min；4℃終止反應。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，4℃保存備用。

1.2.3 焦磷酸測序。使用50μL標記有生物素的PCR產物與200μg鏈霉親和素包被的磁珠，在室溫25℃下孵育20min。用vacuum prep tool將與磁珠結合后的PCR產物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；變性緩沖液洗5s；最后移到清洗緩沖液中清洗10s；vaccum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入80℃烘箱2min，再冷卻到室溫。此時將分離的單鏈 DNA 上機使用SNP檢測方法進行檢測。

1.2.4 重復性試驗。對三種基因型的基因材料進行焦磷酸測序重復試驗，分別各重復3次，對結果進行統計分析。

1.2.5 方法的應用。對山東地區進境的荷斯坦奶牛55份全血樣品提取基因組，按照所建立的方法先進行PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后進行PCR產物的單鏈分離，上機檢測。

2 結果

2.1 PCR 擴增結果

根據Assay Design SW 軟件設計的擴增引物擴增目的片段長度為126bp，經過摸索，PCR擴增條件及體系如1.2中所描述，PCR產物進行瓊脂糖凝膠檢測，大小與目的條帶一致，特異性良好。

圖1 PCR擴增產物電泳圖

2.2 焦磷酸測序

測序片段經過單鏈分離純化后經過PyroMark ID系統測序能夠檢測出片段的DNA序列，按照已知的基因片段的序列，可以迅速識別所測的基因型，三種基因型的測序結果如圖2所示。

2.3 重復性試驗

在一周的時間內對三種不同基因型的基因材料進行3次SNP檢測，檢測結果與已知基因型一致。測序結果與序列核苷酸同源性達到100%，3次檢測結果之間的CV值小于5%，該方法具有很好的重復性。

2.4 方法的應用

55份樣品PCR擴增均得到單一的大小正確的電泳條帶，利用設計的的焦磷酸測序引物進行SNP檢測，發現了1份A/a基因型的樣品，將樣品PCR產物送去測序結果與檢測結果一致（圖3）。

3 討論

CVM是一種常染色體隱性遺傳病，經過患牛的系譜追蹤發現，該突變基因來源于美國的著名公牛Carlin-MIvanhoe Bell（1667366）及其父親Pen-state Ivanhoe Star（1441440），基因分型顯示，它們都是CVM的雜合子，由于其具有優良的生產性能，因此其精子被廣泛應用于全球的奶牛育種業，從而也造成了有害基因的廣泛傳播[10-11]。

我國每年從澳大利亞進口牛數萬頭，同時也從國外進口優良牛精液進行育種，如果母牛是CVM的攜帶者，其后代公牛也有可能成為CVM的攜帶者，如果這樣的攜帶者被培育為種公牛，那么Bell的“故事”將再次上演。因此，我們不僅需要對育種公牛進行篩查，同時對于育種母牛也需要對其基因型進行鑒定，盡量排除CVM攜帶者作為母本的可能，將CVM的傳播從根源進行控制。

圖2.三種基因型焦磷酸測序結果

表2三種基因型基因材料檢測結果重復性比較

圖3 CVM攜帶者焦磷酸測序及測序結果

本研究根據CVM的遺傳學基礎，建

立了焦磷酸測序技術應用于CVM檢測的方法。該方法不同于Sugar法測序，具有無需制膠、無需毛細管、無需熒光染料和同位素的優點，同時它還具有高通量、實驗設計靈活、序列分析簡單、結果準確可靠等優點[12-13]。該方法操作簡便，可以用于對CVM不同基因型進行檢測。同時方法具有很好的重復性，可以應用于CVM基因型分型、攜帶者篩查及奶牛育種工作中。

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Development and Application of Pyrosequencing for Detecting Holstein Bovine Complex Vertebral Malformation

Wang Qun，Sun Tao，Zheng Xiaolong，Zhang Xiaowen，Jiang Fang，Zhao YuRan

（Shandong Exit and Entry Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266002）

To develop a rapid and high-flux molecular method for detection of complex vertebral malformation（CVM），one pair of PCR primers and one sequencing primer were designed according to the gene sequence of bovine SLC35A3 gene by the Assay Design SW software. The PCR products of three different genotypes were detected via pyrosequencing method. There was one CVM carrier detected in 55 blood samples from imported Holstein bovine population. The pyrosequencing result was conf rmed by sequencing of PCR product of the CVM carrier.

CVM；pyrosequencing；Holstein bovine

S858.23；Q7

：A

：1005-944X（2014）10-0070-04

本課題為國家質檢總局科技項目（2012IK016）

脊柱畸形綜合征（complex vertebral malformation，CVM）是奶牛的一種常染色體隱形遺傳性疾病。該病2000年由丹麥學者Agerholm首次報道[1]，隨后在全球其他國家也相繼有所報道[2-4]。Thomsen等證實了牛CVM 是由于編碼UDP-N-乙酰葡糖胺載體的溶質轉運家族35-3（solute carrier family 35 member 3，SLC35A3）基因的第4外顯子559位處堿基發生G→T突變，導致編碼蛋白的180位處纈氨酸置換為苯丙氨酸，致使異常的核苷酸糖轉運到高爾基體[6]。CVM的主要臨床表現為早產、死胎及多見于妊娠260天前的流產，對奶牛的繁殖性狀、返情率等有較嚴重的影響。CVM的出生率很低，出生的患病犢牛脊椎彎曲畸形，成活率為零[7]。由于該病隱性缺陷基因攜帶者不表現任何臨床癥狀，隱形缺陷基因可遺傳給子代個體，只有當子代出現隱形純合子時才會被發現并淘汰，這將會給奶牛業的發展造成巨大的損失，同時也不利于奶牛育種的發展。

目前，國際上許多國家已經開始進行奶牛中CVM攜帶者的篩查工作，主要檢測方法為ASPCR、PCR-SSCP和基因測序[6-9]，這些方法不適合大規模批量檢測，本研究利用PCR-焦磷酸測序技術，擬建立一種快速高通量檢測CVM的方法。