骨髓間充質干細胞全細胞抗原干預肺癌細胞系A 549移植瘤生長的實驗研究

李 靜 陳 軍 李秀玉

1.海軍總醫院中醫科，北京100048；2.陜西中醫學院針灸推拿系，陜西咸陽712046

骨髓間充質干細胞全細胞抗原干預肺癌細胞系A 549移植瘤生長的實驗研究

李 靜1陳 軍2李秀玉1

1.海軍總醫院中醫科，北京100048；2.陜西中醫學院針灸推拿系，陜西咸陽712046

目的觀察骨髓間充質干細胞（MSCs）的全細胞抗原（WCAs）對人肺腺癌細胞株A549荷瘤的影響，并探討腫瘤相關增殖抗原的改變揭示其可能的抑制機制。方法全骨髓貼壁法原代培養小鼠MSCs，取3~5代MSCs以15 Gy X線滅活獲取WCAs，將BALB/c小鼠隨機分成實驗組和對照組，每組各24只。實驗組皮下接種WCAs（1次/3 d，共2周），獲得免疫接種小鼠模型，對照組皮下注射同體積的磷酸緩沖液。觀察兩組小鼠腫瘤生長情況，測量腫瘤直徑、計算腫瘤體積，并于接種后第7（Day7）、30天（Day30）行Western blot及實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測增殖細胞核抗原（PCNA）及Ki-67因子的蛋白及mRNA水平。結果肺腺癌A549細胞皮下移植成功使小鼠荷瘤，實驗組小鼠的腫瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05）；實驗組PCNA蛋白水平顯著低于對照組[Day7：（6.42±0.54）比（18.67±0.96），P＜0.01；Day30：（2.12±0.14）比（4.32±0.25），P＜0.05]；PCNA mRNA水平低于對照組[Day7：（11.64±0.28）比（25.18±1.37），P＜0.01；Day30：（2.11±0.18）比5.69±0.41），P＜0.01]；實驗組Ki-67蛋白水平顯著低于對照組[Day7：（1.57±0.51）比（4.84±0.23），P＜0.05；Day30：（2.75±0.28）比（5.66±0.19），P＜0.01]；Ki-67 mRNA水平也明顯下調[Day7：（2.12±0.43）比（5.94±1.03），P＜0.01；Day30：（3.71±0.72）比（8.62±0.35），P＜0.01]。結論采用MSCs獲得全細胞抗原進行免疫應激可產生抑制腫瘤生長作用，其機制可能與及腫瘤增殖相關因子PCNA、Ki-67的下調有關，其內在的免疫分子機制有待深層次的探索。

骨髓間充質干細胞；腫瘤；免疫治療

免疫治療不僅能增強機體的主動抗腫瘤能力，識別殺傷腫瘤細胞，同時還避免了傳統治療的毒副作用。腫瘤特異性抗原和相關抗原能夠激發機體的免疫系統，產生特異性抗腫瘤免疫，從而識別和殺傷腫瘤[1]。最新的理念認為，選取盡可能全面的腫瘤抗原作為應激抗原可以最大程度實現腫瘤免疫應激，從而激發抗腫瘤作用。因此，如何獲取最為理想的腫瘤抗原成為腫瘤免疫研究的熱點。當前，全腫瘤細胞抗原（WCAs）、樹突細胞荷載腫瘤全抗原、抗原多重修飾等等研究正初步展開[2-3]；有意思的是，有學者基于腫瘤細胞與干細胞的相似性，提出通過“胚胎類物質”或“干細胞”等獲得抗原進行荷瘤免疫，發現胚胎干細胞的WCAs對大腸癌細胞皮下移植瘤有明顯抑制作用[4]。

目前，對于骨髓間充質干細胞（MSCs）全抗原對于腫瘤預防免疫應激的研究尚無報道。MSCs屬于成體干細胞，存在于骨髓基質中可向三個胚層組織進行誘導分化，取材簡單、培養容易，且其研究及臨床運用均不存在倫理爭議[5]。本研究采用MSCs為目的瘤苗制備WCAs，分次對小鼠進行預防接種后進行以人肺腺癌A549細胞荷瘤造模，觀察腫瘤生長情況并初步探索分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（日本TOYOBO東洋紡定量PCR儀器型號：Biored IQ5）；凝膠成像系統（美國ProteinSimple公司）；低溫高速離心機（美國Beckman公司）。

1.2 實驗動物與主要試劑

BALB/c野生小鼠（軍事醫學科學院）；RPMI-1640、低糖型培養基（DMEM）（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰白酶干粉（美國Sigma公司）；10×多聚賴氨酸（北京中杉公司）；膠考馬斯亮藍（美國Sigma）；BCA蛋白濃度測定藥盒（PIERCE公司）；丙烯酞胺（美國Sigma）；甲又丙烯酞胺（美國Sigma）；Tris堿（上海生工生物技術公司）；一抗anti-PCNA，anti-Ki-67（美國Santa）；二抗-辣根（北京中杉公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSCs培養、鑒定及A549培養①MSCs：全骨髓貼壁法培養MSCs，6周小鼠的股骨和脛骨，以10%胎牛血清（FBS）-低糖DMEM沖出骨髓，直接接種在培養瓶里，24~48 h后去懸浮，再接下來的每3~4天換液，直到需要傳代。②人肺腺癌A549細胞：從液氮罐中取出A549細胞凍存管，放入37℃水浴鍋中解凍，1000 r/min離心5 min，PBS吹打清洗重新離心后，以10%FBS+5%RPMI-1640培養，每2~3天換液，直到需要傳代。

1.3.2MSCs全細胞抗原制備、免疫應激BALB/c小鼠及實驗分組X線照射裂解法獲得抗原，具體如下調整3~5代A549細胞密度為1×106，接種于培養皿中行X線照射，照射強度為15 Gy；照射后的抗原4℃保存不超過6 h。獲得WCAs后，根據是否接受抗原刺激將BALB/c小鼠隨機分成兩組，每組各24只；其中實驗組小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗應激（抗原液加PBS共2 mL），2周后（共5次）進行腫瘤荷瘤造模。對照組小鼠每3天接受1次皮下注射2 mL的PBS，同樣2周后行荷瘤造模。

1.3.3 A549皮下移植造模及腫瘤測量獲得復蘇后3~4代A549細胞，調整細胞密度為1×106接種小鼠上肢下方（腋窩下）皮膚，接種后分別于第3、5、7、15、21、30天觀察腫瘤增長情況；處死小鼠后，取下腫瘤組織，測量最長徑與最短徑，計算腫瘤體積，公式為公式V=2πab/6（a為長徑，b為短徑）。

1.3.4Wes tern b l ot檢測PCNA、Ki-67蛋白表達接種后第7、30天，提取細胞總蛋白，紫外分光光度計檢測蛋白濃度后將蛋白上樣，以堆積膠80 V，分離膠120 V，電泳時間90min；移入玻璃皿中加入Coomassie染色液2 h后脫色；再轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育，一抗的封閉液稀釋為1∶20，同時抗人GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）單克隆抗體作為陽性對照，其封閉液稀釋為1∶1000。室溫作用2 h，TBST沖洗5 min×4次；辣根酶標記二抗，封閉液稀釋為1∶2000，室溫1 h后TBST沖洗；定影、顯影。結果用數碼相機攝取并用NCBI的Melanie Viewer 7.0軟件分析進行圖像分析，測定各個條帶的灰度值，將SIRTI條帶灰度值與其相應的GAPDH條帶灰度值相比較，每組所得數值求均數。

1.3.5 Rea l-t ime PCR檢測PCNA、Ki-67 mRNA表達接種后第7、30天，提取細胞總RNA提取，所得RNA溶解于DEFC水中；紫外分光光度計測定總RNA濃度取2μL總RNA稀釋至600μL，測260處光密度OD值，RNA濃度（μg/mL）=OD×300×40。加入逆轉錄及PCR擴增反應體系。擴增過程：取2μL模板，在25μL PCR擴增反應體系中先將模板于97℃，2 min，加入Taq DNA聚合酶，循環儀中循環35次。PCR擴增條件及引物見表1。反應完成后，取10μL PCR反應液在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色后照相，軟件系統掃描。以目的mRNA擴增帶的平均光密度對GAPDH mRNA擴增帶平均光密度的比值代表組織中目的mRNA的表達水平。

表1 PCNA、Ki-67和GAPDH的Real-time PCR引物與條件

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs形態

原代接種1 d即可見較多貼壁細胞，外觀呈紡錘形和多角形，并可見細胞核，48～72 h后細胞數量明顯增多，呈現纖維長條樣梭型細胞；圖1示不同放大倍數下MSCs的形態，可看到不甚均一的梭型排列的細胞，400倍鏡下可見到有部分細胞細胞核內有雙核仁。

圖1 MSCs倒置顯微鏡下形態

2.2 移植瘤體積及其增殖曲線評估

分別對兩組小鼠的腫瘤進行測量，首先評估體內腫瘤增殖情況，如圖2所示，實驗組皮下移植腫瘤明顯小于對照組；進一步解剖獲得腫瘤，分別測量兩組腫瘤的最長徑與最短徑計算出其體積，第3天時，對照組移植瘤的短徑及長徑均大于實驗組，但是差異無統計學意義（P＞0.05），然而自第5天開始，MSCs抗原進行預防接種，實驗組其短經與長徑都小于對照組（P＜0.05）；第3、5、7、15、21、30天實驗組體積均明顯小于對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表2。并進一步獲得其增殖曲線，發現實驗組的增殖趨勢明顯低于對照組。

表2 兩組移植瘤直徑及體積的比較（x±s）

圖2 移植瘤體積及增殖曲線

2.3MSCs全細胞瘤苗抗原對PCNA及Ki-67的影響

MSCs作用后，腫瘤組織的PCNA及Ki-67的表達都明顯下調，本研究檢測了7、30 d的PCNA與Ki-67的表達，可見在蛋白水平及mRNA水平PCNA與Ki-67的表達，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3、圖3~4。

表3 兩組PCNS及Ki-67表達水平比較（x±s）

圖3 兩組PCNA、Ki-67的蛋白表達情況

圖4 兩組PCNA、Ki-67的m RNA表達

3 討論

腫瘤免疫治療源于Burnet提出的“腫瘤免疫監視”理論，認為機體的免疫系統能夠通過細胞免疫機制識別并產生免疫應答。研究表明，該種免疫應答的機制十分復雜，涉及多種免疫細胞及其分泌的產物，包括T淋巴細胞、NK細胞、NC細胞和巨噬細胞等免疫細胞介導的特異或非特異的細胞免疫，抗體介導的體液免疫以及補體、細胞因子的抗腫瘤作用[6]；因此，探索有效、安全的應激源即“識別”是免疫治療的基礎[7]。

腫瘤的胚胎特性的認識由來已久，并且二者在增殖分化、侵襲、血管侵蝕和新生血管形成、免疫逃逸及細胞凋亡等諸多方面具有驚人的相似性[8]：二者表達相同的表面抗原，即癌胚抗原（carcino-embryonic antigens，CEA），在腫瘤狀態時會使得機體一些機體發育過程中許多原本“關閉”的基因激活，可重新生成和分泌這些胚胎期的蛋白如甲胎蛋白、CEA、FSA等[9-10]。正是基于此，研究者開始探索干細胞與腫瘤的關系。大量研究，在多種實體腫瘤中都存在少數具有干細胞特性即自我更新能力和多向分化潛能的細胞亞群，這種細胞亞群被稱為腫瘤干細胞，其對腫瘤形成、復發、轉移及化療耐藥性都有著重要影響[11]。2009年，Li等[4]創新性地發現以胚胎干細胞體外制作瘤苗可以起到抑制腫瘤增殖的作用，這項研究也使得人們在瘤苗探索的道路上多了新的思路，即干細胞可以作為瘤苗來源。那么，除了胚胎干細胞別的干細胞是否具有類似的作用呢？

本研究首次評估了MSCs作為瘤苗具有腫瘤免疫接種作用。筆者以X線照射MSCs獲得裂解抗原，每周3 d一次給予BALB/c小鼠皮下接種，連續4周獲得瘤苗應激模型；再以GFP-A549皮下注射對其進行荷瘤造模，并設置第3、5、7、15、21、30天觀察腫瘤增殖情況，本研究發現瘤苗接種組從第3天開始其腫瘤體積小于對照組，并且隨著時間的延長，其差別愈發明顯，說明疫苗應激產生的抑瘤作用可能是長期的。Li等[4]采用胚胎干細胞系H9獲得疫苗，觀察其免疫刺激后荷瘤的增殖情況，同樣發現自第3天開始其免疫應激的抑瘤作用開始凸顯；又有學者比較胚胎干細胞瘤苗對于不同數量的腺瘤細胞移植后腫瘤增殖的影響，發現無論移植初始細胞計量多少，干細胞瘤苗均可以產生明確的抑瘤作用[12]。

PCNA由Miyachi等[13]于1978年在系統性紅斑狼瘡患者的血清中首次發現并命名，因其只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內而得名；Mathews等[14]發現PCNA與細胞周期蛋白（Cyclin）屬于同一物質，并與細胞增殖程度直接相關；后來人們在乳腺癌、肺癌、肝癌、大腸癌等多種腫瘤中都監測到PCNA表達的上調[15-16]；總之，在不同的調控通路中，PCNA可以作為多種蛋白的功能轉換因子發揮作用。在細胞增殖、分化及凋亡事件中，PCNA都參與了十分重要的角色，尤其是反映細胞增殖狀態的良好指標。Ki-67是一種大分子蛋白質，存在于細胞核內，1993年，學者得出其氨基酸序列[17]，發現其包含有40個弱的和10個強的PCST區（富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）；研究顯示，Ki-67與細胞增殖至關重要，可以用來識別生長中的正常和腫瘤細胞，評估細胞的增殖程度，但對靜止期的細胞無作用，故Ki-67已成為細胞增殖的標志之一；研究者發現Ki-67的作用是在有絲分裂過程中有維持DNA規則結構的重要作用，是具有結合特性的重要的結構蛋白，在細胞增殖過程中不可缺少[18]；研究已經證實其在乳腺癌[19]、肺癌[20]、結直腸癌[21]等幾乎所有的惡性增殖的腫瘤中都高表達。

因此，為了初步評估MSCs瘤苗用于A549的接種的分子機制，本研究檢測了第7、30天接種組和對照組腫瘤增值因子PCNA及Ki-67的蛋白及mRNA表達情況。正如本研究結果中描述的一樣，瘤苗應激刺激后無論蛋白水平和RNA水平，PCNA及Ki-67的表達都顯著下調，從而推測，瘤苗可能由于免疫狀態的改變下調了抑制瘤的增殖活性，從而抑制了移植瘤的增殖。當然，細胞的免疫通路紛繁復雜，其內在的具體的分子通路及免疫機制有待進一步深入研究。

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Research of vaccination with whole cells antigens from mesenchymal stem cells generate an antitumor effect of lung cancer cell line A549 in vivo

LIJing1CHEN Jun2LIXiuyu1
1.Department of Traditional Chinese Medicine,Navy General Hospital,Beijing 100048,China;2.Department of Acupuncture and Massage,Shaanxi University of Chinese Medicine,Shaanxi Province,Xianyang 712046,China

Ob jective To observe the influence ofwhole cell antigens(WCAs)ofmesenchymal stem cells(MSCs)on lung cancer cell line A549,discuss the change of related antigen of tumor proliferation,and reveal the possible inhibition mechanism.M ethods The MSCs was isolated and cultured adherent cells from marrow,and then 3-5 generations MSCswere inactivated by X-ray(15 Gy),and theWCAs were obtained the BALB/c ratswere divided into experimental group and control group random ly,with 24 rats in each group.The rats of experimental group were injected subcutaneousWCAs(1 time per 3 days,2 weeks),the control group immunized subcutaneously with PBS,the immunizationmousemodelswere obtained.The growth of rats tumor weremonitored,tumor volume was plotted,and the expression of PCNA,Ki-67 both in protein and mRNA level were monitored by Western blot and Real time-PCR respectively in 7(Day7),30 d(Day30)after inoculation.Resu lts A well-established lung cancer(A549)model was established,the tumor volume ofmice in the experimental group was significantly less than that of the control group(P＜0.05);the expression of PCNA protein in experimental group were significantly lower than that of the control group [Day7:(6.42±0.54)vs(18.67±0.96),P＜0.01;Day30:(2.12±0.14)vs(4.32±0.25),P＜0.05];level of PCNA mRNA was lower than that of the control group[Day7:(11.64±0.28)vs(25.18±1.37),P＜0.01;Day30:(2.11±0.18)vs(5.69±0.41), P＜0.01];the Ki-67 protein of the experimental group was significantly lower than that of the control group[Day7: (1.57±0.51)vs(4.84±0.23),P＜0.05;Day30:(2.75±0.28) vs(5.66±0.19),P＜0.01],the levelofKi-67mRNAwas also down regulated significantly[Day7:(2.12±0.43)vs(5.94±1.03),P＜0.01;Day30:(3.71±0.72)vs(8.62±0.35),P＜0.01].Conclusion Vaccination of rats with MSCs generated consistent anticancer effect of lung carcinoma,which is further confirmed by low expression of PCNA and Ki-67 compared with controls.While the further immunemechanism need more exploring.

Mesenchymal stem cells;Cancer;Immunotherapy

R734.2

A

1673-7210（2014）08（a）-0004-05

2014-04-15本文編輯：任念）

國家自然科學基金資助項目（編號81102678）。

李靜（1981-），女，博士研究生；研究方向：惡性腫瘤的中醫治療。