基于DArT標記的三疣梭子蟹地理種群遺傳多樣性分析

榮曄婧，陳 強，史雨紅，陳 炯

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室, 浙江 寧波315211)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(portunus)，是一種重要的大型海產經濟蟹類，廣泛分布于中國、日本、朝鮮及馬來西亞群島等海域，它具有肉質好、生長快、產量高等優點，經濟價值高，養殖利潤豐厚，隨著海水養殖的快速發展，三疣梭子蟹養殖已成為各沿海地區的主導養殖品種。

目前，三疣梭子蟹養殖業的蟹苗主要還是依靠野生資源，但由于環境惡化、病害和過度捕撈導致野生資源急劇下降，嚴重限制了養殖業的發展[1]。因此迫切需要對野生資源進行保護，了解三疣梭子蟹的野生種群遺傳結構，為開展優良、抗逆品種的選育提供科學依據，保持中國三疣梭子蟹養殖業的持續健康發展。據報道，同工酶[2,3]、16S rRNA、線粒體DNA、COI、CR、ITS1基因片段序列分析[4-6]、隨機擴增多態性 DNA (RAPD)[7]、擴增片段長度多態性(AFLP)[8]、微衛星標記(SSR)[1,9,10]等技術均以廣泛應用于研究三疣梭子蟹種群內和種群間、或與其它相近物種之間的遺傳關系。但上述技術存在檢測位點少、篩選周期長、自動化程度低，需已知基因組序列信息等缺點。

多樣性芯片技術(diversity arrays technology, DArT)是一種新遺傳標記技術，綜合了基因芯片、AFLP、PCR、分子克隆等技術[11]，不需已知基因組序列，因此十分適合研究非模式生物[12]。同時，它具有高通量和低成本的顯著特點，較好地克服了以往跑電泳凝膠為主的標記技術產量低、成本高、耗時長、自動化程度低以及依賴核酸序列信息等缺點[13]，是一種比較理想的遺傳標記技術，已成功應用于水稻、大麥和木薯等多種農作物[11,13-16]和細菌[17]的遺傳多樣性和種質鑒定研究。本研究先構建三疣梭子蟹基因組代表性DNA文庫，從中擴增獲得基因組代表性DNA片段，用于點制多樣性芯片。再通過雜交獲得DArT標記，重新點制多態性富集芯片，通過熒光信號強度轉換獲得0/1矩陣，從而分析5個三疣梭子蟹地理種群遺傳多樣性，以期為三疣梭子蟹野生種群保護及選育提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

本研究所用5個地理種群的三疣梭子蟹樣品，分別取自中國由南到北的5個不同區域：丹東(DD)、煙臺(YT)、青島(QD)、連云港(LYG)、寧波(NB)，分別代表黃海的鴨綠江口種群；渤海的萊州灣種群；會場野生種群；海州灣種群；東海的舟山種群。以上5個種群都于2011年取樣，所有樣品殼平均長度11.51 cm±1.22 cm，平均體重164.4 g± 19.7 g，雌雄比例1∶1?；铙w運回實驗室，取大螯于-80℃冰箱中保存備用。

大腸桿菌TOP10F’由實驗室保存，PstI、TaqI 、T4 DNA連接酶購自Takara公司，氨芐青霉素、X-gal、LB培養基、SSC、1 kb DNA ladder和SDS購自上海生工生物工程公司，DecaLabel DNA Labeling Kit購自Fermatas公司，ExpressHybTM雜交液購自Clontech公司，鮭精DNA購自Sigma公司，Cy3-dCTP和Cy5-dCTP購自GE公司。

1.2 基因組代表性DNA片段文庫構建

方法參照Jaccoud等[11]描述。采用酚-氯仿法提取基因組DNA，并將不同地理種群三疣梭子蟹基因組DNA等量混合。100 ng混合基因組DNA用PstI和TaqI進行酶切。在T4 DNA連接酶作用下，純化的DNA連接上PstI特異性接頭(5’-CACGATGGATC CAGTGCA-3’與5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’退火而成)。連接產物作為模板用于后續PCR擴增，所用引物為DArT-PstI引物 (5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’ )[13]，反應程序如下：94℃變性5 min；94℃ 變性30 s，53℃復性30 s，72℃延伸1 min，72℃延伸反應10 min。擴增產物克隆至載體pMD19-T，轉化大腸桿菌TOP10F’并涂布于含氨芐青霉素和X-gal的LB培養基上。

1.3 基因組代表性DNA芯片點制

從基因組代表性DNA文庫中隨機挑選單菌落，利用質粒載體上的通用引物M13F-47和M13R-48對插入的DNA片段進行PCR擴增，產物用異丙醇沉淀。采用晶芯?SmartArrayerTM48 微陣列芯片點樣儀進行芯片點制，同時在芯片上設置一系列陽性和陰性對照。

1.4 芯片雜交和清洗

各地理種群基因組DNA(50 ng)用酶切、加接頭、PCR擴增操作如上。各地理種群代表性基因組DNA片段用1倍體積異丙醇濃縮10倍，變性后用DecaLabel DNA Labeling Kit進行Cy3標記，加入含十堿基隨機引物的5×緩沖液、MixC、Cy3-dCTP、exo-Klenow fragment共2.1 μL，37℃孵育10 min后，加入dNTPs 0.4 μL，37℃孵育30 min，加入0.1 μL EDTA(pH值8.0)終止反應。參考DNA為pMD19-T載體多克隆位點片段并進行Cy5標記。Cy3和Cy5標記反應產物混合，再加入1 μL鮭精DNA(10 g/L)和50 μL ExpressHybTM雜交液混合后，96℃變性3 min，冰浴驟冷1 min。DArT芯片在紫外交聯儀中250 mJ交聯備用。雜交反應在晶芯?雜交儀中進行，65℃孵育過夜。雜交后先用0.3× SSC, 0.1% SDS 清洗1次，再用0.06× SSC清洗2次，離心甩干。

1.5 數據提取及處理

雜交后采用晶芯?LuxScanTM10K-A 雙通道激光共聚焦掃描儀進行掃描，并用LuxScan3.0 軟件進行數據的提取。若對應的參考DNA雜交熒光強度較弱，則屬于壞點，棄之。質量符合條件的探針，其對應的熒光強度按照log[cy3target/cy5reference]進行計算并均一化，利用模糊C-均值聚類分析法(模糊度為1.5)及ANOVA獲得0或1標記矩陣。最后探針對應的結果必須滿足：在90%的芯片中置信水平P>0.95(賦值概率采用聚類算法)；符合前述條件時，在某張芯片上如果P<0.95則標記為缺失(×)。

1.6 5個三疣梭子蟹種群遺傳關系分析

1.6.1 多樣性芯片(discovery arrays) 在本研究中，首先從隨機挑取的2500個基因組代表性DNA文庫克隆中擴增候選DArT標記，點制成多樣性芯片，每個點重復3次。此外，質控包括探針結合質控、陽性雜交質控、陰性雜交質控、空白。

1.6.2 多態性富集芯片(polymorphism-enriched arrays) 將篩選獲得的上述候選DArT標記重新點制成多態性富集芯片，每個點重復3次。芯片共35行、27列，每個DArT標記重復3次，每個點的位置用“行標-列標”表示。其中1-1～1-3為HEX探針結合質控，1-4～1-18為陰性質控，1-19～1-21為陽性質控，1-22～1-27為空白，35-22～35-27為三疣梭子蟹陽性探針。

來自于5個三疣梭子蟹野生種群PstI/TaqI代表性片段與多態性富集DArT芯片雜交，并重復1次。依據上述數據處理原則，獲得穩定的0/1矩陣。采用PHYLIP 3.695軟件的RESTDIST和NEIGHBOR程序，用Nei/Li方法計算遺傳距離并構建非加權組平均法(UPGMA)系統發生樹[18]，用SEQBOOT程序進行bootstrap分析，重復次數為1000計算各分支的置信度[19]。

2 結果

2.1 基因組DNA代表性DNA文庫構建

本研究中基因組DNA完整，純度高，無RNA污染(圖1A)。將5個三疣梭子蟹地理種群基因組DNA等量混合，PstI和TaqI完全酶切后純化(圖1B)。在T4DNA連接酶作用下，純化的DNA酶切片段與PstI特異性接頭連接。連接產物作為模板進行后續PCR擴增(圖1C)。PCR產物克隆至pMD19-T載體后轉化大腸桿菌Top10F’，所得基因組DNA代表性DNA文庫滴度≥105，陽性克隆平均插入片段長度>500 bp(圖1D)，符合DArT芯片點制要求。

A：5個三疣梭子蟹地理種群基因組DNA，M—1 kb DNA ladder；A1—丹東，A2—煙臺，A3—青島，A4—連云港，A5—寧波；B：混合基因組DNAPstI和TaqI酶切檢測 (5 μL)；C：加pstI接頭后PCR擴增；D：基因組DNA代表性文庫插入片段電泳檢測結果，1～24—隨機選取的克隆。

圖1三疣梭子蟹基因組DNA代表性片段文庫構建

Fig 1 The construction of genomic representations library

2.2 采用DArT芯片技術分析三疣梭子蟹不同地理種群的親緣關系

5個三疣梭子蟹地理種群經多樣性芯片分型，初步篩選獲得313個DArT標記，多態性效率為12.5%。5個三疣梭子蟹地理種群再次與多態性富集芯片雜交，獲得穩定的0/1矩陣。數據分析顯示Q>71%，call rate>93.5%，不一致性(discordance)<0.01，符合質量標準。

圖2采用多態性富集芯片確定5個三疣梭子蟹地理種的群遺傳多樣性

Fig 2 Identification of genetic diversity of five geographical populations of the swimming crab detected on the polymorphism-enrichedPstI/TaqI arrays

313個候選多態性標記的多態信息含量(polymorphism information content, PIC)介于0.32～0.48，中間值為0.40，較高于隨機選擇的雙等位基因位點的多態信息含量。系統進化樹顯示了5個三疣梭子蟹地理種群之間的遺傳關系，其中青島和連云港的種群最先成簇，再與寧波種群成簇(圖3)，這可能是由于青島和連云港都屬于黃海，寧波位于東海，黃海和東海兩個水域之間存在基因交流。

根據313個PstI/TaqI多態性標記構建UPGMA系統樹圖，分叉處數值表示1000次重復抽樣所得到的置信度百分比，只顯示置信度50 %以上的數值。

圖3 5個三疣梭子蟹地理種群之間的遺傳關系

Fig 3 Genetic diversity of five geographical populations of the swimming crab

重復性驗證先采用不同生長階段和不同環境的寧波地區三疣梭子蟹樣品制備6份PstI/TaqI代表性片段，每份樣品重復雜交1次。這個基因型雜交call rate為98%。重復實驗中2次賦值結果一致性為99.1%，絕大部分(96%)DArT標記在不同的樣品雜交結果中賦值相同。其余4%在6個樣品雜交中結果不同，這可能是由于發育或環境造成了基因組甲基化不同。這些DArT標記顯然不適合包含在基因分型芯片中。另外，重復性驗證還采用同一樣品不同個體的代表性DNA片段進行雜交。3個樣品，每個樣品2個個體。結果顯示，兩個個體之間差異在0.7%～1.6%之間，這是個體遺傳異質性造成的。

3 討論

本研究構建的三疣梭子蟹基因組代表性DNA文庫滴度≥105，陽性克隆平均插入片段長度>500 bp。多樣性芯片包括2500個基因組代表性DNA，作為候選多態性DNA，雜交篩選獲得313個DArT標記，多態性效率為12.5%。上述多態性標記重新點制成多態性富集型DArT芯片，雜交顯示Q>71%，call rate>93.5%，不一致性(discordance)<0.01，符合質量標準。以0/1矩陣數據格式，分析了5個三疣梭子蟹地理種群間的遺傳多樣性。

基因組復雜性降低方法決定了基因組代表性文庫的多態性效率。PstI和TaqI酶切組合是DArT技術中降低基因組復雜度常用組合，在已報道文獻中證明此組合能獲得更高的多態性效率[13,16]，本研究中采用該酶切組合構建PstI和TaqI酶切，多態性效率為12.5%。對于遺傳變異小的生物，基于PstⅠ的基因組復雜性降低方法構建的基因組代表性文庫的多態性效率甚至不到10%，因此改進原有技術或者尋求新的基因組復雜性降低方法，提高文庫中差異片段的比例，對于提高DArT技術的效率非常重要[20]。此外，由于PstI是甲基化敏感限制性內切酶[13]，所以基因組甲基化程度也將影響多態性效率。

PIC是DArT技術的一個重要指標。Botsein[21]首先提出了衡量基因變異程度高低的多態信息含量指標，當PIC>0.5時，表明該遺傳標記可提供豐富的遺傳信息；當0.25

DArT技術已在農作物的遺傳多樣性分析中得到有效應用[11,13-16]。目前，該技術還尚未在水產動物中應用。三疣梭子蟹地理種群遺傳多樣性分析主要是形態學方法、CR基因序列分析、SSR分子標記技術。在形態學上，鴨綠江口、萊州灣、海州灣、舟山4個野生種群的三疣梭子蟹中，海州灣、舟山2個種群形態最為接近，鴨綠江口和萊州灣2個種群形態較為接近[23]。馮冰冰等[24]利用線粒體CR基因片段序列分析，表明青島、連云港、象山遺傳距離較近。李曉萍[22]采用SSR標記技術對5個種群(舟山、海州灣、青島即墨會場、萊州灣、鴨綠江口)的野生三疣梭子蟹的遺傳多樣性進行了比較分析，結果表明，即墨會場和海州灣兩個種群遺傳距離最近，萊州灣種群與這4個種群的遺傳距離較遠。Liu等[1]研究了山東半島5個地區三疣梭子蟹的遺傳結構，表明煙臺和青島遺傳距離較遠。此外，本研究顯示的結果與文獻報道一致，說明DArT技術準確地反映了地理種群之間的遺傳多樣性。

綜上所述，本研究報道了一種高通量的DArT技術，可用于三疣梭子蟹遺傳多樣性分析，可獲得穩定并明確的遺傳分型圖譜，將有助于三疣梭子蟹自然資源遺傳多樣性研究和開展優良品種選育工作。

參考文獻：

[1]Liu Y G, Guo Y H, Hao J, et al. Genetic diversity of swimming crab (Portunustrituberculatus) populations from Shandong peninsula as assessed by microsatellite markers[J]. Biochem Syst Ecol, 2012a, 41:91-97.

[2]王國良, 金 珊, 李 政, 等. 三疣梭子蟹養殖群體同工酶的組織特異性及生化遺傳分析[J]. 臺灣海峽, 2005, 24(4): 474-480.

[3]余紅衛, 朱冬發, 韓寶芹. 三疣梭子蟹不同組織同工酶的分析[J]．動物學雜志, 2005, 40(1): 84-87.

[4]郭天慧, 孔曉喻, 陳四清, 等. 三疣梭子蟹線粒體DNA、16S rRNA和COI基因片段序列的比較研究[J].中國海洋大學學報, 2004, 34(1): 22-28.

[5]Xu Q H, Liu R L, Liu Y. Genetic population structure of the swimming crab,Portunustrituberculatusin the east China sea based on mtDNA 16S rRNA sequences[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2009, 371(2):121-129.

[6]李遠寧, 馬 朋, 劉 萍, 等. 三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus) 4 個野生群體ITS1序列分析及系統進化分析[J]. 海洋與湖沼，2012, 43(4):769-774.

[7]金 珊, 趙青松, 王春琳, 等. 梭子蟹科六種海產蟹的RAPD標記[J]. 動物學研究, 2004, 25(2): 172-176.

[8]Liu L, Li J, Liu P, et al. A genetic linkage map of swimming crab (Portunustrituberculatus) based on SSR and AFLP markers [J]. Aquaculture, 2012b, 66-81: 344-349.

[9]韓智科, 劉 萍, 李 健, 等. 三疣梭子蟹選育家系微衛星分析[J]. 水產學報, 2012, 36(1): 25-31.

[10]Guo E, Cui Z X, Wu D H, et al. Genetic structure and diversity ofPortunustrituberculatusin Chinese population revealed by microsatellite markers[J]. Biochem Syst Ecol, 2013, 50:313-321.

[11]Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, et al. Diversity arrays: a solid state technology for sequence independent genotyping [J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29: e25.

[12]James K E, Schneider H, Ansell S W, et al. Diversity arrays technology (DArT) for pan-genomic evolutionary studies of non-model organisms[J]. PLoS ONE, 2008, 3(2): e1682.

[13]Wenzl P, Carling J, Kudrna D, et al. Diversity arrays technology (DArT) for whole-genome profiling of barley [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(26): 9915-9920.

[14]Xia L, Peng K, Yang S Y, et al. DArT for high-throughput genotyping of Cassava (Manihotesculenta) and its wild relatives[J]. Theor Appl Genet, 2005, 110(6): 1092-1098.

[15]Akbari M, Wenzl P, Caig V, et al. Diversity arrays technology (DArT) for high-throughput profiling of the hexaploid wheat genome[J]. Theor Appl Genet, 2006, 113(8): 1409-1420.

[16]Bolibok-Bragoszewska H, Heller-Uszyńska K, Wenzl P, et al. DArT markers for the rye genome-genetic diversity and mapping[J]. BMC Genomics, 2009, 10: 578.

[17]Hackl E, Konrad-K?szler M, Kilian A, et al. Phage-type specific markers identified by diversity arrays technology (DArT) analysis ofSalmonellaentericassp. enterica serovars Enteritidis and Typhimurium[J]. J Microbiol Meth, 2010, 80(1): 100-105.

[18]Nei M, Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76(10):5269-5273.

[19]Felsenstein J. PHYLIP-phylogeny inference package (version 3.2) [J]. Cladistics, 1989, 5:164-166.

[20]馮艷麗, 武 劍, 王曉武. 多樣性序列芯片技術(DArT)的原理及應用[J]. 中國蔬菜, 2010(2): 1-6.

[21]Botstein D, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet, 1980, 32(3): 314-331.

[22]李曉萍. 三疣梭子蟹微衛星富集文庫的構建及五個野生地理群的多樣性分析[D]. 青島: 中國海洋大學，2010: 40-51.

[23]高保全, 劉 萍, 李 健, 等. 三疣梭子蟹4個野生種群形態差異分析[J]. 中國水產科學, 2007, 14(2): 223-228.

[24]馮冰冰, 李家樂, 牛東紅, 等. 中國四大海域三疣梭子蟹線粒體控制區基因片段序列比較分析[J]. 上海水產大學學報, 2008, 17(2): 134-139.