胰島素對鵝原代肝細胞增殖及蛋白合成的影響

楊文蘭，韓春春，王繼文，劉丹丹，萬火福, 劉賀賀，潘志雄

(四川農業大學 動物遺傳育種研究所，成都 611130)

胰島素是機體內唯一促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素，是一種重要的體內調節因子[1]。胰島素能夠刺激許多類型的細胞和組織內蛋白質的合成[2]，同時在體外胰島素對細胞增殖與分化具有促進作用[3]，但其對不同細胞體系的增殖作用有所不同[4]。早期的研究發現，對一些細胞體系特別是成纖維細胞, 胰島素需在超出其生理濃度的高濃度下才有顯著的促增殖作用。低濃度胰島素(100 ng/mL)能誘導多發性骨髓瘤細胞增殖，生理濃度胰島素(50 ng/mL)能促進腫瘤細胞增殖2～4倍[5]。有報道認為胰島素具有促進肝再生的作用[6]，能夠刺激小鼠肝細胞增殖[7]。在生產上通過對水禽進行填飼碳水化合物生產肥肝，導致肝臟和身體其它部位生長速度急劇增加，因此推測水禽具有很強的細胞增殖能力和蛋白合成功能。填飼誘導肥肝的生成伴隨著血漿胰島素濃度的升高[8]，我們推測胰島素對肝細胞增殖和蛋白合成具有促進作用。本實驗通過將不同濃度的胰島素作用于鵝原代肝細胞，檢測胰島素對細胞增殖和蛋白合成的影響，為研究水禽肥肝生成機理奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 鵝原代肝細胞的分離與培養

采用半原位Seglen二步膠原酶灌注法分離3只天府肉鵝(Ansercygnoides)的肝細胞。全培養基包括EMDM低糖培養基和胎牛血清，將肝細胞接種到35 mm培養皿和6孔培養板中，靜置在40 ℃、5% CO2氣相和飽和濕度的CO2培養箱中培養。3 h后用PBS清洗3次后更換為10%血清培養基，培養24 h后換無血清培養基，再繼續24 h后更換為加0 nmol/L、5 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L及200 nmol/L不同濃度胰島素處理的培養基，培養48 h后取樣，每個處理重復3次。

1.2 細胞上清液谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(GPT)濃度測定

鵝肝細胞經不同濃度的胰島素處理48 h后用2 mL EP管收集細胞培養液1 mL，用自動生化分析儀檢測細胞上清液中ALT、AST濃度。

1.3 細胞上清液總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)濃度的測定

鵝肝細胞經不同濃度的胰島素處理48 h后用2 mL EP管收集細胞培養液1 mL，用自動生化分析儀檢測細胞上清液中TP、ALB濃度。

1.4 Brdu-ELISA法檢測DNA含量

96孔板中鵝肝細胞加入葡萄糖處理24 h后每孔加入BrdU 10 μL標記細胞。棄液后加入固定液室溫固定30 min使DNA變性，洗滌3次后加入BrdU一抗，洗滌后加入山羊抗小鼠IgG過氧化物酶共軛結合物，洗滌，添加TMB過氧化物酶作用底物，加入終止反應液終止反應，將96孔板放酶標儀上用450 nm波長檢測各孔吸光度(OD值)。OD值越高表示樣品中DNA含量越高。

1.5 統計學處理

采用SPSS ll.5統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，多組間指標的比較均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，LSD—t和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰島素對肝細胞培養上清液中AST和ALT濃度的影響

圖1表明，與對照組相比，50 nmol/L、100 nmol/L和150 nmol/L胰島素對鵝肝細胞培養上清液中AST濃度影響不顯著(P>0.05)，200 nmol/L胰島素明顯增加了鵝肝細胞培養上清液中ALT濃度，而幾個濃度的胰島素對培養上清液中AST濃度沒有明顯影響(P<0.05)。

2.2 胰島素對鵝肝細胞培養上清液中TP和ALB濃度的影響

圖2表明，與對照組相比，50 nml/L胰島素對鵝肝細胞培養上清液中TP和ALB濃度沒有明顯影響(P>0.05)，100 nml/L、150 nml/L和200 nml/L胰島素顯著增加細胞培養上清液中TP和ALB的濃度(P<0.05)。

圖1 不同濃度胰島素對鵝肝細胞培養上清液ALT和AST濃度的影響

圖2 不同濃度胰島素對鵝肝細胞培養上清液TP和ALB濃度的影響

2.3 不同濃度胰島素對鵝原代肝細胞DNA合成的影響

圖3 不同濃度胰島素對鵝肝細胞DNA合成的影響

Brdu-ELISA法檢測DNA含量結果如圖3所示，與對照組相比，隨著胰島素濃度增加鵝原代肝細胞內DNA合成的量增加。50 nmol/L、100 nmol/L和150 nmol/L 3個胰島素處理組的鵝原代肝細胞DNA合成量差異顯著(P<0.05)。

3 討論

ALT主要存在于肝細胞漿內，只要有1%的肝細胞壞死，就可以使血清酶增高1倍。AST主要存在于肝細胞的線粒體內，只有當肝臟發生嚴重壞死或破壞時，才能引起谷草轉氨酶的血清濃度偏高。ALT和AST的正常參考值為0～40 U/L。本實驗通過檢測肝細胞培養上清液ALT和AST的濃度反映胰島素對肝細胞損害情況的影響。實驗結果顯示，不同濃度胰島素處理后的鵝原代肝細胞ALT和AST含量差異不明顯(P<0.05)，且都在正常范圍內，說明0～200 nmol/L胰島素沒有損害鵝肝細胞的功能。

越來越多的實驗證明在體外胰島素對細胞增殖有促進作用。胰島素可明顯促進小鼠血管平滑肌細胞[9]、心肌細胞[10]、成纖維細胞[11]、人白血病細胞[12]、腫瘤細胞[5]及骨髓瘤細胞[13]的增殖作用。Wahner Hendrickson等用不同濃度胰島素(1.7～1722 nm/mL)作用于HL-60、U937、ML-1 細胞48 h后，結果顯示1.7 nmol/L的胰島素可促進細胞增殖，隨著濃度增高，促增殖作用增強，各細胞系的最佳促進濃度不一，進一步加大濃度，促增殖作用逐漸減弱[4]。本實驗BrdU-ELISA法結果表明在胰島素濃度為0～200 nmol/L時，隨胰島素濃度的增加，細胞增殖率增加，說明0～200 nmol/L胰島素可以促進鵝原代肝細胞增殖。

胰島素能刺激胚胎細胞、成骨細胞和成纖維細胞及骨骼肌的蛋白合成功能[ 4,14,15]。研究表明胰島素可以明顯促進小鼠血管平滑肌細胞膠原蛋白的合成[9]，10-7nmol/L胰島素對小鼠心肌細胞蛋白合成的促進作用最為明顯[11]。另外，研究表明胰島素通過激活mRNA翻譯快速促進肌肉蛋白合成[16，17]，飼喂小鼠引起的胰島素分泌的增加如果被藥物抑制，導致蛋白翻譯啟動阻止和蛋白合成抑制[18]。本實驗結果顯示50 nmol/L胰島素對鵝原代肝細胞培養上清液中總蛋白和白蛋白濃度沒有明顯影響，而100 nmol/L、150 nmol/L和200 nmol/L胰島素顯著增加鵝原代肝細胞培養上清液中總蛋白和白蛋白的濃度，表明胰島素能夠激活鵝原代肝細胞的蛋白合成功能，而具體的調控機制還有待于進一步研究。

總之，0～200 nmol/L胰島素對鵝原代肝細胞中蛋白合成和細胞增殖具有促進作用，高濃度時促進效果更為明顯。

參考文獻:

[1]Aas A M, Hanssen K F, Berg J P, et al. Insulin-stimulated increase in serum leptin levels precedes and correlates with weight gain during insulin therapy in type 2 diabetes[J]. J Clin Endocrino Metab, 2009, 94(8):2900-2906.

[2]Proud C G. Regulation of protein synthesis by insulin[J]. Biochem Soc Trans, 2006, 34: 213-216.

[3]Le Flem G, Pecher J, Le Flem-Bonhomme V, et al. Human insulin A-chain pep tide analog(s) with in vitro biological activity[J]. Cell Biochem Funct, 2009, 27( 6 ):370-377.

[4]Straus D S. Growth-stimulatory action of insulin in vitro and in vivo[J]. Endocr Rev, l984, 5(2):356-369.

[5]Doepfner K T, Spertini O, Arcaro A, et al. Autocrine insulin-like growth factor-I signaling promotes growth and survival of human acute myeloid leukemia cells via the phosphoinositide 3-kinase /Akt pathway[J]. Leukemia, 2007, 21(9) : 1921-1930.

[6]Farivar M, Wands J K, Isselbacher K J, et al. Effect of insulin and glucagon on fulminant murine hepatitis[J]. N Eng J Med, 1976, 295(27):1517-1519.

[7]安 威, 梅懋華. 肝再生刺激因子對小鼠實驗性急性肝損傷的保護作用[J].生理學報,1991,43(5):415-427.

[8]Han C C, Wang J W, Xu H Y, et al. Effect of overfeeding on plasma parameters and mRNA expression of genes associated with hepatic lipogenesis in goose[J]. Asian-Aust J Anim Sci, 2008, 21:590-595.

[9]王旭開, 王 燕, 楊成明, 等. 胰島素對大鼠血管平滑肌細胞增殖及膠原蛋白合成的影響[J]. 第三軍醫大學學報,2006,28(24):2416-2418.

[10]范雪暉, 王紅霞, 徐振平.不同濃度胰島素對體外培養新生鼠心肌細胞生長和增殖的影響[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2008,l2(28):5466-5469.

[11]洪華山, 林 嵐, 王一波, 等. 胰島素促進心肌成纖維細胞增殖和心肌細胞肥大的作用[J]. 中國病理生理雜志,2002,18(5):505-509.

[12]莊偉煌, 潘敬新. 胰島素對人白血病細胞增殖的影響[J]. 中國實驗血液學雜志,2011,19(1) : 269-273.

[13]Sprynski A C, Hose D, Kassambara A, et al. Insulin is a potent myeloma cell growth factor through insulin /IGF-1 hybrid receptor activation[J]. Leukemia, 2010, 24( 11) : 1940-1950.

[14]Fujita S, Rasmussen B B, Cadenas J G, et al. Effect of insulin on human skeletal muscle protein synthesis is modulated by insulin-induced changes in muscle blood flow and amino acid availability[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006, 291: 745-754.

[15]O′Connor P M, Kimball S R, Suryawan A, et al. Regulation of translation initiation by insulin and amino acids in skeletal muscle of neonatal pigs[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003, 285: 40-53.

[16]Guillet C, Prod′homme M, Balage M, et al. Impaired anabolic response of muscle protein synthesis is associated with S6K1 dysregulation in elderly humans[J]. FASEB J, 2004, 18(13): 1586 1587.

[17]Kimball S R, Jurasinski C V, Lawrence J C Jr, et al. Insulin stimulates protein synthesis in skeletal muscle by enhancing the association of eIF-4E and eIF-4G[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 1997, 272: 754-759.

[18]Sinaud S, Balage M, Bayle G, et al. Diazoxide-induced insulin deficiency greatly reduced muscle protein synthesis in rats: involvement of eIF4E[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 1999, 276: 50-61.