GCRV及其細胞滅活苗對草魚4種酶活性的影響

袁雪梅, 沈錦玉, 藺凌云, 潘曉藝, 姚嘉赟, 徐 洋, 尹文林, 郝貴杰，2

(1. 浙江省淡水水產研究所，浙江 湖州 313001； 2. 寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

草魚是中國淡水養殖四大家魚之一，在其養殖過程中疾病頻發成為阻礙草魚養殖規?；l展的瓶頸。在所有病原中，以草魚呼腸孤病毒(Grasscarpreovirus, GCRV)危害最大，導致損失嚴重。草魚出血病是一種高傳染性、高致死性的病毒性疾病，是中國淡水水產養殖中最為突出的問題之一[1，2]。

魚類的免疫體系包括特異性免疫和非特異性免疫，在感染各種病原體初期，抗體尚未形成，主要靠非特異性免疫發揮功能。非特異性免疫受許多環境因子影響，溫度、攝食狀況、擁擠等因子國內外已有很多報道[3]，對病原微生物感染后魚體的變化研究多從病理學及激活抗原-抗體反應的特異性免疫的角度進行，較少有考察感染病原微生物對魚類感染初期非特異性免疫功能方面的報道。本文以不同濃度的草魚呼腸孤病毒通過腹腔注射感染草魚，同時用草魚呼腸孤病毒細胞滅活苗免疫草魚，然后于不同時間取血及肝臟，通過測定酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活力變化趨勢來研究病毒感染及疫苗免疫對草魚非特異性免疫功能的影響。以期為魚類在感染病原微生物以及免疫疫苗后的非特異性免疫響應研究提供可借鑒的手段，在魚類的抗病分析、疾病預報等方面提供應用前景。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞及實驗魚

草魚呼腸孤病毒(JX2008)由本實驗室分離保存。草魚腎細胞系(CIK)由本實驗室傳代保存。用于本研究的草魚購自浙江省淡水水產研究所苗種基地，體重為10～15 g，分別置于4個體積約為300 L自動充氣水循環系統圓柱形水缸中飼養, 每缸放40尾，飼養2周，水溫保持( 26±1)℃，試驗期間每天投喂顆粒性餌料2次，投餌之前先吸污換水。

1.2 病毒培養、細胞苗制備及免疫注射

將保存于液氮中的JX2008病毒接種于長成致密單層的CIK細胞，室溫下吸附1～2 h, 吸棄病毒液，加入與培養液等量的維持液(含3%FBS的DMEM)，28℃恒溫培養。每日觀察細胞形態，直至出現80%細胞病變，收取病毒液進行滴度測定。病毒滴度按常規方法[4]進行測定。將滴定好的病毒與甲醛溶液混合，甲醛的終濃度為0.2%，于28℃溫育72 h。然后接種于長成致密單層的CIK細胞，觀察是否有細胞病變。

3組實驗魚用MS222溶液(1 mg/L)麻醉，第1組G1為高濃度感染組，每尾草魚經腹腔注射TCID50為1×106的草魚呼腸孤病毒0.1 mL，第2組G2為低濃度感染組，每尾草魚注射TCID50為1×103的草魚呼腸孤病毒0.1 mL，第3組G3為疫苗組，每尾草魚注射細胞滅活疫苗0.1 mL，第4組G4為每尾注射同等劑量的滅菌生理鹽水作為對照。

1.3 樣本采集

分別在實驗開始的第1、2、7和14 d取樣，每組隨機選取4尾實驗魚。實驗魚用MS222(1 mg/L)深度麻醉，尾靜脈采血1.0 mL。室溫靜置待其凝固，4℃冰箱靜置過夜，4000 r/min離心10 min，收集上層血清，用于ACP、AKP、MPO、SOD活性的測定。同時迅速剝離肝臟組織，濾紙吸干水分后稱重，加入無菌生理鹽水于冰浴中勻漿，使濃度達到0.1 g/mL，在4℃條件下，以3000 r/min離心10 min，除去沉淀后獲得草魚的肝臟組織提取液，并以其作為酶原液進行酶活性測定，置于4℃冰箱中備用。

1.4 酶活力測定

組織蛋白含量的測定和ACP、AKP、SOD、MPO活力的測定，均采用南京建成生物公司提供的檢測試劑盒，相應操作參照說明書進行。各組織中蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。ACP及AKP活力測定均采用磷酸苯二鈉法。ACP活力單位定義為每克組織蛋白(或100 cm3血清)在37℃與基質作用30 min產生1 mg酚為1個活力單位(U/g或10-2U/cm3)。AKP活力單位定義為每克組織蛋白(或100 cm3血清)在37℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個活力單位(U/g或10-2U/cm3)。SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測定，活力單位定義為1 mg組織蛋白在1 cm3反應液(或1 cm3血清)中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個活力單位(103U/g或U/cm3)。MPO活力采用過氧化氫還原法測定，活力單位定義為每克組織濕片在37℃的反應體系中H2O2被分解1 μmol為1個酶活力單位。

1.5 數據分析

所有數值均為平均值±標準差。各處理組與對照組之間各項免疫指標的差異用SPSS軟件(16.0)中的單向方差分析法(ANOVA)進行分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酸性磷酸酶活力

不同處理組草魚在1、2、7、14 d血清中酸性磷酸酶活性結果見圖1。試驗結果表明G1、G2組及G3組在各個時間點酸性磷酸酶活性有所變化，但是較對照組的差異均不顯著。不同處理組草魚在1、2、7、14 d肝臟中酸性磷酸酶活性結果見圖2，各組肝臟中酸性磷酸酶活力大體呈現先降低后升高的趨勢，其中G1組在第2 d極顯著低于對照組，第14 d時顯著高于對照組；G2組在第1 d時顯著低于對照組；G3組在第1、14 d時顯著高于對照組，第7 d時顯著低于對照組。

圖1 不同處理組草魚血清中酸性磷酸酶活力的變化情況

注：*表示該組與對照組差異顯著(P< 0.05)；**表示該組與對照組差異極顯著(P< 0.01)，下同。

圖2 不同處理組草魚肝臟中酸性磷酸酶活力的變化情況Fig 2 The change of ACP activity in grass carp liver in different treatment groups

2.2 不同處理組草魚血清及肝臟提取液中堿性磷酸酶活力

不同處理組草魚在1、2、7、14 d血清中堿性磷酸酶活性結果見圖3。試驗結果表明G1組堿性磷酸酶活力呈現先升高后降低的趨勢，在第7 d時達到最高值，極顯著高于對照組，到第14天時極顯著低于對照組；G2組堿性磷酸酶活力呈現持續升高的趨勢，在第7 d時，極顯著高于對照組，到第14 d時，顯著低于對照組；G3組呈現升高的趨勢，在第2、7 d時顯著高于對照組，到第14 d時顯著低于對照組。

不同處理組草魚在1、2、7、14 d肝臟中的堿性磷酸酶變化情況如圖4所示，G1、G2組堿性磷酸酶均呈現先降低再升高再降低的趨勢，其中G1組在第1、7 d時極顯著高于對照組，到第14 d時極顯著低于對照組；G2組在第1、2、7 d時均極顯著高于對照組，在第14 d時極顯著低于對照組；G3堿性磷酸酶活力呈現先升高再降低的趨勢，在第1、14 d時極顯著低于對照組，在第2、7 d時極顯著高于對照組。

圖3 不同處理組草魚血清中堿性磷酸酶活力的變化情況Fig 3 The change of AKP activity in grass carp serum in different treatment groups/d

圖4 不同處理組草魚肝臟中堿性磷酸酶活力的變化情況Fig 4 The change of AKP activity in grass carp liver in different treatment groups

2.3 不同處理組草魚血清及肝臟提取液中髓過氧化物酶活力

不同處理組草魚在1、2、7、14 d血清中髓過氧化物酶活性結果見圖5。試驗結果表明3個處理組的變化趨勢不盡相同。其中G1組髓過氧化物酶活性呈上升趨勢，與對照組相比，在第1 d時極顯著低于對照組，第2 d時顯著低于對照組；G2組呈先升高再下降的趨勢，與對照組相比，在第2 d時極顯著高于對照組；G3組呈現升高降低再升高的趨勢，與對照組比較，在第1、2 d時極顯著高于對照組，第7 d時顯著低于對照組。

不同處理組草魚在1、2、7、14 d肝臟中髓過氧化物酶活性結果見圖6，G1組髓過氧化物酶活性呈現先降低再升高再降低的趨勢，在第14 d時極顯著低于對照組；G2、G3組均呈現先升高再降低的趨勢，其中G2組在第1 d時顯著低于對照組，第7、14 d時極顯著低于對照組，G3組在第7 d時極顯著高于對照組。

圖5 不同處理組草魚血清中髓過氧化物酶活力的變化情況Fig 5 The change of MPO activity in grass carp serum in different treatment groups

圖6 不同處理組草魚肝臟中髓過氧化物酶活力的變化情況Fig 6 The change of MPO activity in grass carp liver in different treatment groups

2.4 不同處理組草魚血清及肝臟提取液中超氧化物歧化酶活力

不同處理組草魚在1、2、7、14 d血清中超氧化物歧化酶活性結果見圖7，G1組呈現先升高再降低的趨勢，在第2 d的時候極顯著高于對照組，第7 d的時候顯著高于對照組，第14 d時極顯著低于對照組；G2組呈現升高的趨勢，第1 d時極顯著低于對照組；G3組呈現先升高再降低再升高的趨勢，在第2、7 d時均極顯著高于對照組。

圖7 不同處理組草魚血清中超氧化物歧化酶活力的變化情況Fig 7 The change of SOD activity in grass carp serum in different treatment groups

不同處理組草魚在1、2、7、14 d肝臟中超氧化物歧化酶活性結果見圖8。結果顯示，G1組的先升高后降低的趨勢，與對照組比較，第1、2 d均顯著高于對照組，第7 d時極顯著高于對照組，第14 d顯著低于對照組；G2組呈現降低的趨勢，與對照組比較，第1、2、7 d均顯著高于對照組，第14 d時極顯著低于對照組；G3組呈現先降低后升高的趨勢，但與對照組相比差異不明顯。

圖8 不同處理組草魚肝臟中超氧化物歧化酶活力的變化情況Fig 8 The change of SOD activity in grass carp liver in different treatment groups

3 討論

3.1 ACP作為溶酶體酶的重要組成部分，在魚類等低等脊椎動物及軟體動物中，保證了溶酶體有效完成防御和消化的雙重功能。ACP活性程度可以判定巨噬細胞激活程度，同時反映機體的免疫機能狀況。郭偉榮等[5]發現鰻弧菌感染使花鱸血清中ACP活性顯著升高，證明花鱸的巨噬細胞被激活，抗應激水平提升，增強了花鱸對病原微生物的抵御能力。馬騫等[6]用哈維氏弧菌感染條紋斑竹鯊后，其組織及血清中ACP總體呈現先抑制后誘導的趨勢，表明條紋斑竹鯊在感染哈維氏弧菌后，體內的吞噬作用開始受到抑制而后逐漸恢復并被大量激活。在本實驗中，各處理組草魚肝臟中ACP活力呈現先降低后升高的趨勢，提示體內的吞噬作用先受到抑制而后被激活，血清中ACP的活性均小于肝臟中ACP的活性，這與其它水產動物及高等脊椎動物ACP在不同組織中分布情況相同[7]。已有研究表明，應激對魚類的非特異性免疫細胞具有抑制作用, 造成吞噬細胞的吞噬能力降低[8]。本實驗中各處理組血清中ACP的活性有所變化，但是與對照組的差異均不顯著，可能是由于魚體的應激抑制了吞噬作用，伴隨吞噬作用而釋放的水解酶并未被大量激活所致，但還需進一步證實。

3.2 AKP主要分布于機體的肝臟，在正常情況下這些血清酶活性低且相對穩定，是血細胞溶酶體的特征酶，會對異物產生水解破壞作用[9]。陳寅兒等[10]和郭偉榮等[5]證明鱸魚及花鱸在受到細菌感染后血清中AKP的含量上升。在本實驗中各處理組草魚血清中的AKP均有上升趨勢，這一結果與前兩位研究結果相似。在第7 d的時候3個處理組活性均極顯著高于對照組，其中G1組活性最大，說明AKP活性與刺激物濃度有一定關系。

3.3 MPO是動物體內參與免疫防御的重要氧化酶之一[11,12]，和H2O2和鹵化物組成了抗細菌及其它微生物體系，在非特異性免疫中發揮極為重要的作用。髓過氧化物酶催化過氧化氫和氯化物反應生成次氯酸鹽，后者可以與胺鹽反應生成氯胺，在它的作用下使機體快速、強烈的殺滅微生物[5,13]。孫虎山等[11]發現免疫促進劑及可促進櫛孔扇貝血細胞中MPO的生產及向血清中釋放,免疫多糖可增強櫛孔扇貝血淋巴MPO活性，王宜艷等[12]發現中國對蝦口服復合免疫藥物后，血清中MPO活力明顯增高。王江勇等[14]發現雜色鮑感染病毒能促進MPO在血細胞的產生并逐漸釋放進血清中。本實驗中，各處理組血清和肝臟中MPO活性大體呈現先上升再下降的趨勢，說明刺激物進入魚體能促使MPO的產生和釋放，隨著時間的增長，MPO活性受到抑制。

3.4 SOD能專一地清除體內有害的自由基，以解除自由基氧化體內的某些組分而造成的機體損害。關于水產動物組織中SOD酶活性受有關物質影響的實驗所得結論不一致[7, 15-17]。郭偉榮等[5]用鰻弧菌感染花鱸后，實驗組SOD活性與對照組比較無顯著差異，表明花鱸對鰻弧菌的體內吞噬作用抑制和消除了自由基的形成，使SOD的活性變化不明顯，可以保持細胞免受損害，從而維護細胞的正常結構和功能。本實驗中3個處理組SOD活性變化不盡相同，G1組無論血清還是肝臟中活性均呈現先上升再下降的趨勢，分析其原因可能是感染初期機體內吞噬作用產生活性氧，在活性氧誘導下SOD活力提高，此后SOD活力下降可能是隨著感染時間增長，體內吞噬作用的進一步恢復并增強機體產生大量的活性氧, 但SOD清除活性氧的能力有限,同時魚體內的氧化酶反應系統需要通過協調各種酶的變化以抵抗活性氧對機體的傷害，因此SOD活力受到抑制。G2組血清呈現上升趨勢，肝臟呈現下降趨勢，G3組血清呈現先上升再下降再上升的趨勢，肝臟呈現先下降再上升的趨勢，兩個處理組血清和肝臟中SOD活性變化趨勢均相反，但是這兩個組織中SOD活性總和除了第7 d趨于穩定，表明體內SOD活性維持一個動態平衡。

3.5 本文中所用的GCRV為弱毒株，高低濃度均未使草魚發病，剖檢內臟未見明顯病變，從免疫學角度可以說明GCRV進入魚體起到弱毒疫苗的作用，文中高、低濃度GCRV及其細胞滅活苗對4種酶活影響不同說明疫苗的種類和疫苗的劑量都會對機體非特異性免疫應答產生影響。

在養殖草魚的病害防治過程中，化學藥物和抗生素的使用對環境和食品安全存在著潛在的危害，這對水產病害防治技術研究提出了更高的要求，免疫防治成為目前研究的熱點之一，因此對草魚非特異性防御體系的認識是非常必要的。本文著重從非特異性免疫的角度討論了病毒感染和疫苗免疫后，魚類非特異性免疫體系所做出的反應，為魚類在感染病原微生物以及免疫疫苗后的非特異性免疫響應研究提供參考。

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