胡桃楸不同營養器官POD同工酶的動態變化

張麗敏, 薛 晶, 封彥杰, 張衛東, 王 仲

(佳木斯大學 生命科學學院, 黑龍江 佳木斯 154007)

胡桃楸( Juglans Mandshurica Maxim)又名核桃楸、山核桃，為胡桃科胡桃屬落葉喬木。主要分布于中國東北及華北地區，是東北地區著名的“三大硬闊樹種”之一，為珍貴用材，也是著名的藥用植物。同工酶是基因的直接產物，具有明顯的種屬、組織和發育階段特異性。過氧化物酶(POD)同工酶是植物體中常見的氧化酶，廣泛參與多種生理活動，植物體內的許多生理過程及植物的不同發育時間、環境條件的變化常與POD同工酶的種類及活性有關[1-3]。目前，有關胡桃楸研究的報道較多，但對胡桃楸POD同工酶的研究還未見報道[4-8]。本試驗通過對胡桃楸不同器官POD同工酶進行生長期動態測定、比較分析，旨在掌握其同工酶譜帶的變化規律，為更好地了解山核桃生長期特點，探討山核桃生理代謝、發育特點與同工酶譜帶的關系，為促進胡桃楸食藥用開發利用、引種栽培提供生化水平參考。并試圖為進一步探討藥用次生代謝產物的生成與POD活性大小及同工酶譜帶數的消長關系，為探索山核桃藥源不同生長發育期的特征提供相應的檢測生化指標[1, 9-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胡桃楸整個生長周期可分為生長和休眠兩個階段，北方樹種于5月初葉片開始萌發，10月末落葉，即5月—11月為胡桃楸的生長期，11月—次年4月為休眠期。生長期內生命活動旺盛，同工酶類、次生代謝產物等表達和積累豐富，故本供試材料胡桃楸取自黑龍江省佳木斯市四豐山生長結實較好的成片山核桃林，于2012年5月—11月，每月15日—20日取胡桃楸10棵優樹混合得到樹根、樹皮(莖皮)、枝皮、樹枝(當年生枝條)、樹葉5個營養器官樣品。依次用1，2，3，4，5編號。所采樣品用濕布包裹，塑料袋封裝，盡快帶回實驗室備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

將胡桃楸各營養器官用清水洗凈，再用蒸餾水漂洗，濾紙吸干后稱重，每克鮮重加4 mL提取液(pH值7.2的蔗糖—磷酸緩沖液)，冰浴下研磨至勻漿狀，4層紗布過濾，將濾液3800 r/min離心15 min，上清液(樣品)置冰箱(-20℃)備用。

1.2.2 電泳

采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳方法，分離膠濃度7.5%,濃縮膠濃度3.5%。4℃恒壓(350 V)電泳，電極緩沖液為pH值 8.3 Tris-Gly系統。樣品點樣量均為15 μL，電泳重復2次。

1.2.3 染色及遷移率(Rf)的測定

采用醋酸聯苯胺法染POD，待酶帶顯現清晰后，用流水漂洗后置蒸餾水中保存，Rf測定按照見參考文獻[13]。

1.2.4 凝膠板的保存

用10%甘油浸泡玻璃紙8 h以上，然后在玻璃板上先放1張玻璃紙鋪平，其上放凝膠，凝膠上再放1張玻璃紙，排除玻璃紙與凝膠間的氣泡，陰干、保存，以備考證。

2 結果與分析

2.1 基本譜型

胡桃楸5個器官疊加后的酶譜型即本實驗所觀察到的胡桃楸POD同工酶基本譜型，共顯現29條酶帶，從負極到正極劃分為A、B、C 3個區。A區Rf=0～0.47，共顯現8條酶帶A1至A8；B區Rf=0.48～0.70，共顯現14條酶帶B1至B14；C區Rf=0.71～1.0，共顯現7條酶帶C1至C7，依染色深淺區分為特強帶、強帶、次強帶、弱帶和痕跡帶5個級別。

2.2 不同器官同工酶酶譜動態特征

2.2.1 根中POD同工酶酶譜變化

從電泳圖譜(圖1)可見，5月至11月，各生育階段根中POD酶帶變化明顯。共顯現15條酶帶，A3、A5、A7、B1、B3、B7、B9、B10、C2、C4這10條酶帶始終表達，為根部的基本譜帶，其中A7、B1、C4在生長期內表達穩定，強度不變，而其余7條皆隨生長期不同，酶表達強度發生變化，其差異可以作為表達各生長發育階段系統發育差異的指標。其中B3、C2兩條表現出5月、10月表達較強，其它月表達較弱的特點。5月天氣漸暖，胡桃楸開始萌芽，此時期屬于休眠轉入生長期階段，10月天氣轉寒，胡桃楸葉片脫落，此時期屬于生長轉入休眠期階段。這兩個時期都為胡桃楸生長期和休眠期的過渡時期，B3、C2在這兩個時期表達較強可作為此過渡時期的特征性酶帶。A3、A5、B7、B9、B10 5條隨生長期延長，出現表達強度的周期變化。A2、B4、B11、B13、C3 5條酶帶表達均表現出生長時期特異性，A2 、B4酶帶出現5、6、7月表達，8、9月逐漸消失，10、11月又逐漸出現的周期性變化，B11、B13酶帶5、6月表達，7月消失，8、9月出現，10月消失，11月再度出現，出現周期性變化。

圖1 根POD同工酶

2.2.2 樹皮(莖皮)中POD同工酶酶譜變化

圖2 莖皮POD同工酶

由電泳圖譜(圖2)可見5月至11月，莖皮中POD酶帶變化明顯，共顯現18條酶帶。A3、A5、A7、B1、B3、B9、B10、B11、C4這9條酶帶皆表達，為莖皮部的基本譜帶，但皆隨生長期不同，酶表達強度發生變化，其差異可以作為表達各生長發育階段系統發育差異的指標。酶帶C4隨生長期延長表達逐漸減弱為痕跡帶，其余8條酶帶均表現出11月表達較弱的特點且隨生長期延長，表達強度表現周期性變化。另外B3酶帶5、10月特異表達，可作為胡桃楸生長與休眠過渡時期的特異表達酶帶。B8酶帶7、8月特異表達，而此兩月中B4、B12酶帶消失，表現出生長期中生殖生長階段特異性。此外莖皮的各酶帶的表達皆出現11月表達強度下降或酶帶消失的特點。北方胡桃楸10月落葉，11月進入冬季，胡桃楸已經進入休眠期，體內的各種生命活動，如：呼吸、蒸騰、芽的分化、根的吸收、養分合成和轉化等，都進行得較微弱和緩慢，所以POD同工酶的表達也整體較弱。

2.2.3 枝皮中POD同工酶酶譜變化

從電泳圖譜(圖3)可見，6月至11月，枝皮中POD酶帶變化明顯，共顯現17條酶帶。B1、B3、B5、B9、B10、B11、B13這7條酶帶始終表達，為枝皮部的基本譜帶，其中B1、B3隨生長期延長，酶帶表達呈現由強漸弱的特點，B5、B9、B10、B11、B13 5條酶帶均表現了8月出現表達強度高峰隨后又下降的趨勢。8月胡桃楸營養生長與生殖生長都達到了高峰期，POD同工酶作為植物生長期表達產生的一種重要的酶類，也從一個側面體現出胡桃楸各階段的生長發育特點。另外 A3、A5、A7、C2、C4 5條酶帶6到10月較穩定表達，11月消失，可作為生長期特征性表達酶帶。而A1、A2兩條酶帶從9至11月特異表達，11月也呈下降趨勢?？傮w上莖皮的同工酶表達也出現11月表達強度下降或酶帶消失的特點。

圖3 枝皮POD同工酶

2.2.4 樹枝中POD同工酶酶譜變化

圖4 樹枝POD同工酶

由電泳圖譜(圖4)可見，5月至9月，枝中僅顯現7條酶帶，變化較明顯。A4、B1兩條酶帶始終表達，為枝部的基本譜帶，且出現弱強弱的強度變化，均為6、7月表達強，A6、A8兩條酶帶5月不表達，B2酶帶9月不表達，B5酶帶5月、9月不表達，B7酶帶8月特異表達?？傮w上枝中的同工酶表達5月酶帶數量最少，其次是9月，而6、7、8月表達數量較多，活性較強。其表達特點與枝在這3個月中旺盛生長表現出一致性。

2.2.5 葉中POD同工酶酶譜變化

由電泳圖譜(圖5)可見，5月至9月，葉中POD酶帶變化明顯，共顯現14條酶帶。A4、B1、B2、B5、C2 5條酶帶始終表達，為葉部的基本譜帶，大致出現先弱后強再弱的強度變化。 A2、A3兩條酶帶9月不表達，A8、C3、C4酶帶5月不表達，6月開始出現并漸強，A6酶帶5月、9月不表達，C5、C7酶帶8、9月特異表達，C6酶帶7月出現并減弱?？傮w上葉中的同工酶表達5月酶帶數量最少，而6、7、9月表達數量較多，8月表達數量最多，活性7、8月表達較強?？梢奝OD同工酶在葉旺盛生長階段表達種類多，活性強，與枝的POD同工酶表達特點相似。

圖5 葉POD同工酶

2.3 不同器官酶譜疊加后的同工酶譜帶特征

同工酶的基因表達存在著時間和空間的差異，為了更加準確地描述同工酶各酶帶的顯現情況，將每個月得到的各器官，根、莖皮、枝皮、枝、葉的酶譜疊加出一個總酶譜(疊加酶譜)，可以直接觀察到生長期中每月各器官中顯現哪些酶帶及共有酶帶數(表1)。

5月POD同工酶4個器官共顯現20條酶帶，6月POD同工酶5個器官共顯現25條酶帶，7月POD同工酶5個器官共顯現27條酶帶，8月POD同工酶5個器官共顯現27條酶帶，9月POD同工酶5個器官共顯現26條酶帶，10月POD同工酶3個器官共顯現19條酶帶，11月POD同工酶3個器官共顯現19條酶帶，每個器官酶帶數及共有酶帶數見表1。

表1 不同生長期各器官疊加酶帶特征

2.4 不同時期酶譜疊加后的同工酶譜帶特征

將根、莖皮、枝皮、枝、葉5個器官的7個月份酶譜疊加出一個總酶譜(疊加酶譜)，可以直接觀察到各器官中每條酶譜帶在生長期中是否顯現以及顯色強度(以顯色最深時期為準)。根中5月至11月共顯現15條酶帶，莖皮中5月至11月共顯現18條酶帶，枝皮中6月至11月共顯現17條酶帶，枝中5月至9月共顯現7條酶帶，葉中5月至9月共顯現14條酶帶，各器官酶帶具體分布情況及顯色強度(表2)。

3 討論

3.1 胡桃楸器官POD同工酶表達具有發育階段性

通過胡桃楸根、莖皮、枝皮、枝、葉5個營養器官POD同工酶的測定分析，可以看出POD同工酶變化因生長時期的不同而不同，一方面，不同生長時期基本酶帶有表達強弱的不同，生長期呈現動態變化，同時另一方面，特定時期某些酶帶特異表達或消失，反映了代謝活動的不同。另外，從不同器官酶譜疊加后7個月的縱向比較，也可看出從萌芽期到落葉轉入休眠期，表達的POD酶種類經歷了由少增多再減少的周期性變化?？梢奝OD可以作為一種重要酶類反映胡桃楸不同生長時期代謝活動的不同[1,14]。

3.2 胡桃楸POD酶帶的共有性和同工酶的器官特異性[14]

將根、莖皮、枝皮、枝、葉的不同月份的電泳圖譜疊加后可見既有共有酶帶、也有各自的特有酶帶(見表2)。5個器官電泳圖譜中均有B1帶，可能此酶帶與胡桃楸的共同特性有關，或者說該酶帶可能是胡桃屬的特征性酶帶。從疊加圖譜中還可見到根中POD同工酶帶數為15條，莖皮中為18條，枝皮中為17條，枝中為7條，葉中為14條，不論從酶譜帶數目還是特有酶帶上來看，胡桃楸POD同工酶表現出明顯器官特異性。

3.3 胡桃楸pod同工酶分析宜采用根、莖皮、枝皮

胡桃楸5個器官中根部、莖皮部、枝皮部pod同工酶的種類多，活性強，酶帶清晰穩定，故pod同工酶分析采用根、莖皮、枝皮部較合適。而枝中整個生長期酶帶數較少(7條)，活性較低；葉中pod同工酶帶分離不清晰，故枝和葉不適合分析測定。

表2 各器官生長期疊加酶帶特征

(其中+：有此酶帶；-：無此酶帶。)

(1級：特強帶；2級：強帶；3級：次強帶；4級：弱帶；5級：痕跡帶)

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