三七總皂苷保護腦缺血再灌注腦損傷機制的實驗研究進展

王海芳

（山東中醫藥大學基礎醫學院2011級中五一班，山東濟南250355）

三七總皂苷（totalsaponins of panax notognseng，PNS）是從三七中提取的有效活性成分，具有減小腦梗死體積、降血脂、改善血腦屏障通透性、清除自由基、抗炎、抗氧化等作用［1］。近年來，對腦缺血再灌注損傷后PNS的神經保護作用機制進行了大量研究，本文就PNS保護腦缺血再灌注腦損傷機制的實驗研究進行綜述。

1 抑制炎癥反應

炎癥反應是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）是主要的致炎因子。TNF-α在腦缺血損傷中起雙重作用，少量的TNF-α對腦缺血損傷起修復和保護作用，過量的TNF-α可誘導神經細胞的損傷。正常情況下，腦內僅有少量TNF-α表達，腦缺血再灌注6 h后TNF-α表達增強，48 h后表達最明顯，提示TNF-α異常表達與腦缺血再灌注損傷有關。PNS可顯著抑制腦缺血再灌注后不同時期內TNF-α的表達，從而減輕腦缺血后TNF-α介導的一系列損傷，減少神經元凋亡的發生［2］。

IL-1也是重要的炎癥反應因子，其中起主要作用的是IL-1β。IL-1β主要通過與IL-1RⅠ結合誘導白細胞黏附，介導白細胞向缺血腦組織浸潤，從而引起腦組織炎癥反應，導致腦組織損傷。研究發現，腦缺血2 h再灌注22 h后，腦組織IL-1β、IL-1RⅠ表達增高，而PNS可降低腦組織IL-1β和IL-1RⅠ表達，對缺血性腦損傷發揮保護作用［3］。

2 抑制神經細胞凋亡

腦缺血再灌注后腦損傷的發生與一些誘導凋亡的基因過度表達有關。Bcl-2基因可抑制過度的細胞凋亡，起到保護腦損傷的作用。研究表明，缺血30 min再灌注24 h后存活腦細胞中Bcl-2高表達，表達主要位于缺血周邊區［4］，因此認為腦缺血再灌注能誘導Bcl-2高表達，Bcl-2蛋白參與腦缺血再灌注損傷的自我保護過程。PNS能顯著上調腦組織內Bcl-2的表達，抑制海馬神經元的凋亡，減輕缺血再灌注后神經細胞損傷［4-5］。

半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶（caspase）活化后可使一系列細胞骨架蛋白及細胞修復酶等裂解，從而導致細胞凋亡［6］。Caspase包括上游調控其他Caspase活化的 caspase-2，8，9，10 及下游直接介導凋亡的caspase-3，6，7 等［7］。研究表明，腦缺血再灌注后腦內 caspase-3，8，9表達增高，經PNS治療后caspase-3和caspase-9的表達降低，而對caspase-8的表達無影響，說明PNS可以通過降低caspase-3和caspase-9的表達而減輕腦缺血再灌注后細胞凋亡［8-9］。

X-連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）屬于凋亡抑制蛋白家族，它可以直接與caspase結合，抑制細胞凋亡［10］。半胱氨酸蛋白酶激活物（second mitochondria-derived activator of caspases，Smac）是一種促凋亡蛋白［11］，可以與 XIAP 的BIR3、BIR2結構域競爭性結合，解除其對 caspase-9、caspase-3的抑制作用，促進細胞凋亡。研究表明，缺血再灌注10 h后，腦神經元中XIAP蛋白表達增高，12 h達到高峰，24 h開始下降，而Smac在再灌注后10 h表達逐漸增高，高峰出現在再灌注后24 h。免疫組化顯示，經PNS治療后XIAP陽性細胞數明顯增多，Smac陽性細胞數明顯減少，提示PNS對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞損傷的保護作用可能與抑制Smac蛋白表達和促進XIAP蛋白表達進而抑制腦細胞凋亡有關［12］。

此外，三七總皂苷抑制腦缺血再灌注后神經元凋亡，還與抑制JNK信號轉導蛋白激活、抑制線粒體凋亡途徑有關。

3 抑制氧化應激反應

研究表明，氧自由基可氧化細胞內的脂質蛋白和核酸，引起細胞損傷和凋亡，是引起缺血再灌注損傷的重要環節［13］。體內的酶類清除劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等，可以清除氧自由基，減輕自由基引起的脂質過氧化損傷。當機體清除氧自由基的能力下降，氧自由基可攻擊細胞膜，引起脂質過氧化反應，形成丙二醛（MDA）和脂質自由基。MDA的含量可以間接反映細胞損傷的程度。研究表明，經PNS治療后缺血再灌注損傷腦組織中MDA含量明顯下降，GSH-PX、SOD活性明顯增高，提示PNS可能通過抑制腦缺血再灌注后的脂質過氧化反應，起到抗脂質過氧化作用［14-15］。另有研究證明，PNS可以降低腦缺血再灌注后腦組織內MDA和NO的含量，抑制過度的氧化應激反應，減輕缺血再灌注后腦組織損傷［16-17］。

4 阻滯細胞內鈣超載

Ca2+是細胞內的第二信使，參與幾乎所有調控細胞功能的信息轉導過程。鈣超載是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一。鈣調蛋白（CaM）是細胞內的主要Ca2+受體蛋白，介導Ca2+對蛋白激酶的刺激。其中CaMKⅡ是Ca2+的重要靶酶，在腦組織含量最高。研究表明，缺血再灌注大鼠海馬及皮層神經元CaMKⅡβ mRNA及蛋白表達顯著增高。經PNS治療后，海馬及皮層組織CaMKⅡβ mRNA及蛋白表達顯著降低［18］，說明PNS能阻滯腦缺血再灌注后細胞內鈣超載，起到保護神經元的作用。另有研究表明，PNS可降低腦缺血再灌注后海馬神經細胞內Ca2+超載，抑制線粒體跨膜電位（Δψm）的下降，保護海馬區細胞線粒體功能，發揮抗腦缺血再灌注損傷［19］。

5 促進神經再生

神經干細胞（NSCs）的增殖、分化可促進受損腦組織結構和功能的修復和重塑［20］，這種作用依賴于多種神經營養因子的協調，包括相關調節因子巢蛋白（Nestin）、腦源性神經營養因子（BDNF）和表皮生長因子（EGF）等。Nestin 是神經干細胞的特異性標記物［21］，Nestin的高表達提示存在NSCs激活。BNDF是神經損傷后，保護神經存活、促進再生的必須因子。EGF可誘導NSCs向神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞分化。腦缺血再灌注后可誘導內源性NSCs的自我修復，但作用有限。PNS在缺血再灌注后1 h、3 h、5 h三個時點均可上調Nestin、BDNF和EGF的表達，說明PNS可以促進受損腦細胞的增殖和修復。另有研究表明，PNS可增加缺血腦組織內源性BDNF的表達，產生神經保護作用，且與劑量呈正相關［22］。

神經生長因子（nerve growth factor，NGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是常見的兩種神經營養因子，在缺血性腦損傷中，均有減輕神經元損傷的作用。腦缺血后2 h即出現NGF mRNA和bFGF mRNA的表達，腦缺血程度與NGF和bFGF表達時間呈正相關性，但腦缺血引起的NGF和bFGF產生的時間短，水平有限，難以發揮持久的保護神經元的作用。研究表明，PNS可顯著增強缺血后NGF和bFGF的表達，減輕缺血神經元的損傷［23］。

6 改善血腦屏障的通透性

腦缺血后血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞導致血管壁通透性增高，發生腦水腫。腦缺血后BBB破壞與內皮細胞基質（endothelial cell matrix，ECM）成分降解和破壞有關。在腦缺血時，白細胞激活、黏附、浸潤于血管內皮和腦組織，產生大量的蛋白水解酶，包括MMP-2、MMP-9等。MMP-9可以降解血管基底膜，破壞血管內皮細胞間的緊密連接導致血腦屏障破壞。敲除MMP-9基因的小鼠腦梗死體積明顯縮小，血腦屏障破壞程度也顯著減輕［24］。組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1）是機體內存在的MMP-9特異性抑制劑，能抑制MMP-9的活性，阻斷MMP-9對細胞外基質和基底膜的降解［25］。研究表明，PNS可顯著提高腦缺血再灌注后腦組織神經元的存活率，減輕腦缺血性損傷，能抑制MMP-9蛋白的表達，增加TIMP-1蛋白的表達，提示三七總皂苷可能通過調節MMP-9、TIMP-1的表達而減輕腦水腫［26］。

細胞因子 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8 等通過炎癥細胞的活化，使BBB的通透性增加。研究表明，腦缺血再灌注后上述炎性細胞因子含量增加，而PNS能降低炎性細胞因子的含量，降低血腦屏障的通透性，發揮其改善腦缺血再灌注損傷的作用［27］。

7 改善能量代謝

ATP是腦組織的主要能量來源，可分解為ADP和AMP。腺苷酸池（TAN）水平和能荷值（EC）是衡量機體、組織和細胞代謝狀態的重要參數，TAN的大小反映了線粒體的氧化呼吸活性和生成高能磷酸化合物的能力，EC是動態反映細胞能量平衡的一個參數［28］，可有效評估組織細胞的能量儲備狀態。Na+-K+-ATP酶催化水解ATP釋放磷酸鹽，直接供給自由能，其活性能反映機體能量代謝水平和生理功能狀態。研究發現，腦缺血再灌注1 h后，腦組織ATP和ADP含量、EC和TAN值顯著下降，Na+-K+-ATP酶活性降低，說明缺血再灌注后腦組織的能量代謝發生嚴重障礙，PNS可提高ATP、ADP含量、EC值以及Na+-K+-ATP酶活性。說明PNS可以改善腦缺血再灌注后能力代謝障礙，保護缺血區腦細胞［29］。

綜上所述，PNS可以通過抑制炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激反應、細胞內鈣超載，改善血腦屏障的通透性、能量代謝及促進神經細胞再生等作用，保護腦缺血再灌注后腦損傷。此外，PNS能延長大鼠頸總動脈血栓形成時間，降低大鼠血小板聚集率［30］，起到抗血栓作用。PNS對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有效治療時間窗不超過5 h，超過5 h后無明顯作用，為臨床應用PNS制劑（如血塞通等）提供了理論依據［31］。

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