p65小干擾RNA對人臍靜脈內皮細胞再灌注后趨化因子CXCL16表達的影響

曾 敏，魏 欣，李 偉，符秀虹，蒙緒卿，陳積雄，王 萍

炎癥反應是缺血再灌注細胞損傷的重要環節，其中許多黏附因子和趨化因子都有參與。近年來，越來越多的研究顯示趨化因子CXCL16參與了心血管疾病的炎癥反應。內皮細胞處于血管最內層，對于冠狀動脈的缺血缺氧、內環境的微小變化最敏感、最迅捷。因此，本研究選擇人臍靜脈內皮細胞作為研究對象，通過對其進行體外模擬缺血再灌注培養，并采用小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)轉染的方法探討缺血再灌注中趨化因子CXCL16的表達及可能的調節機制。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑 人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC)(購自ATCC)，采用添加了內皮細胞生長物、5%胎牛血清和青/鏈霉素的內皮細胞培養基常規培養 (購自美國科學細胞研究實驗室)，siRNA〔美國Santa cruz公司 (sc-29410)〕，Lipofectamine RNAiMAX、Trizol試劑 (美國Invitrogen公司)，iScriptTMcDNA合成試劑盒 (BIORAD公司)，CXCL16 ELISA試劑盒 (美國R＆D Systems公司)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養 將HUVEC復蘇后轉移至新培養瓶，加入內皮細胞培養基中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)條件下孵箱內培養，5～7 d傳代1次，采用0．25%胰蛋白酶消化細胞。

1．2．2 實驗分組 分為4組:(1)對照組:正常內皮細胞培養基培養+siRNA陰性對照轉染;(2)缺血再灌注組:模擬缺血培養液培養30 min后換正常培養液再培養4 h+siRNA陰性對照轉染;(3)p65 siRNA轉染組:正常內皮細胞培養基培養+p65 siRNA轉染;(4)缺血再灌注+p65 siRNA轉染組:模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉染 (對HUVEC轉染p65 siRNA 48 h后再模擬缺血再灌注培養)。

1．3 模擬缺血再灌注培養 將HUVEC培養在包含118 mmol/L氯化鈉、24 mmol/L碳酸氫鈉、1．0 mmol/L磷酸鈉、2．5 mmol/L氯化鈣、1．2 mmol/L氯化鎂、20 mmol/L乳酸鈉、16 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖 (pH調至6．2)的“缺血液”中30 min，然后換為再灌注液即正常培養基進行“再灌注”4 h而實現。

1．4 p65 siRNA轉染 預設計好并經驗證的核因子κB p65特異性siRNA和不與人類任何編碼基因序列一致的對照siRNA均購自Santa cruz公司。將HUVEC接種于6孔板中，每孔2．0×105個細胞，使其在轉染細胞密度30% ～50%融合。于300μl的無血清、無抗生素Opti-MEM中稀釋3．6μl p65 siRNA，混勻。于300μl的無血清、無抗生素Opti-MEM中稀釋6μl轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX(終濃度為20 nmol/L)，混勻。再將兩者混勻，常溫下孵育15 min，轉染48 h后檢測。收獲細胞前再根據實驗需要進行模擬“缺血再灌注”培養。

1．5 核因子κB p65和CXCL16 mRNA實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應 (RT-PCR)檢測 用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA。實時定量RT-PCR使用iScriptTMcDNA合成試劑盒。18 S rRNA作為內對照。實時定量采用SYBR Premix Ex Taq和iQ5實時定量RT-PCR檢測系統(BioRad)。核因子 κB p65上游引物:5′-CCTGGAGCAGGCTATCAGTC-3′， 下 游 引 物:5′-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3′;CXCL16 上游引物:5′-AAGCTTCCATTCTTGGCTCA-3′， 下 游 引 物:5′-AAGCTTCCATTCTTGGCTCA-3′;18 S rRNA 上游引物:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′，下游引物:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′(引物均由北京三博遠志公司合成)。逆轉錄反應:mRNA樣品1μg，iScript逆轉錄酶1μl，5×iScript反應混合物4μl，加無RNase的雙蒸水至20μl，輕輕振蕩混勻，25℃溫育5 min，42℃溫熱30 min，85℃加熱5 min。實時定量RT-PCR反應:cDNA逆轉錄產物 2μl，上下游引物各 0．4μl，SYBR預混劑 10μl(寶生物 DRR041A)，DEPC水(Sigma公司)7．2μl。反應條件:第一步95℃ 30 s，第二步95℃ 5 s后62℃ 30 s，此步運行40個循環，第三步55℃ 15 s，此步運行81個循環。每個樣本3孔，取3批實驗平均值。

1．6 CXCL16的測定 收集各種實驗條件下培養HUVEC的上清液，以1 000 r/min離心5 min(離心半徑8 cm)后再取上清液于-80℃低溫凍存。應用CXCL16檢測試劑盒，采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中CXCL16表達水平，與其他相關蛋白無交叉反應。經過徹底洗滌后用底物3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺 (TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CXCL16呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度 (OD值)，計算樣品濃度。每個樣本3孔，獨立實驗3次取平均值。

1．7 WST-1法檢測細胞存活率 HUVEC按 (7～8)×103/ml濃度接種到96孔板，200μl/孔。每種實驗條件設3孔，按上述實驗方法進行siRNA轉染和模擬缺血再灌注培養后，均更換正常培養基，繼續培養48 h后小心吸棄100μl上清液，加入10μlWST-1液，37℃孵育2 h，震蕩1 min，用全自動酶標儀，波長為450 nm，測定各孔OD值，記錄結果。整個實驗重復3次。細胞存活率= 〔(處理細胞OD值-本底OD值)/(對照細胞OD值-本底OD值)〕×100%。

1．8 統計學方法 采用SPSS 13．0統計軟件進行數據處理。計量資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量比較 對照組、缺血再灌注組、p65 siRNA轉染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉染組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義 (P＜0．05);其中對照組、p65 siRNA轉染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉染組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量較缺血再灌注組均降低，差異有統計學意義 (P＜0．05，見表1)。

2．2 各組上清液CXCL16表達水平比較 對照組、缺血再灌注組、p65 siRNA轉染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉染組CXCL16表達水平比較，差異有統計學意義 (P＜0．05);其中對照組、p65 siRNA轉染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉染組CXCL16表達水平較缺血再灌注組均降低，差異有統計學意義 (P＜0．05，見表2)。

表1 各組核因子κB p65和CXCL16 mRNA相對表達量比較(± s，n=16)Table 1 Comparison of relative expression quantity ofκB p65 and CXCL16 mRNA among various groups

表1 各組核因子κB p65和CXCL16 mRNA相對表達量比較(± s，n=16)Table 1 Comparison of relative expression quantity ofκB p65 and CXCL16 mRNA among various groups

注:與缺血再灌注組比較，*P＜0．05

組別 核因子κB p65 CXCL16對照組 0．14 ±0．29* 1．58 ±0．15*缺血再灌注組 0．69 ±0．21 3．33 ±0．30 p65 siRNA 轉染組 0．07 ±0．02* 1．69 ±0．21*缺血再灌注+p65 siRNA轉染組 0．18±0．03* 1．87±0．21*F 值0．001 0．001 14．896 69．629 P值

表2 各組上清液CXCL16表達水平比較 ± s，ng/ml，n=16)Table 2 Comparison of supernatant CXCL16 expression levels among various groups

表2 各組上清液CXCL16表達水平比較 ± s，ng/ml，n=16)Table 2 Comparison of supernatant CXCL16 expression levels among various groups

注:與缺血再灌注組比較，*P＜0．05

組別CXCL16對照組 736±39*缺血再灌注組 1 510±68 p65 siRNA轉染組 632±45*缺血再灌注+p65 siRNA轉染組 547±32*F 值0．001 509．772 P值

2．3 各組細胞存活率比較 各組實驗處理48 h后，WST-1法測定OD值計算細胞存活率。p65 siRNA轉染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉染組細胞存活率較缺血再灌注組均增高，差異有統計學意義 (P＜0．05，見表3)。

3 討論

趨化因子是一組具有趨化作用的細胞因子，CXCL16是近年來新發現的一種清道夫受體，表達在血管內皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞上。是繼CX3CL1之后發現的第二個能以膜結合形式和分泌型的可溶性分子存在的趨化因子。除了清道夫受體外，CXCL16還具有趨化激活T細胞、參與樹突細胞與T細胞的相互作用、促進細胞增殖和細胞-細胞間黏附等功能，近年來發現其在腫瘤［1-2］、動脈粥樣硬化［3］和缺血再灌注損傷［4］中可能起著重要的作用。

表3 各組細胞存活率比較 (±s，%，n=16)Table 3 Comparison of cell survival rates among various cell groups

表3 各組細胞存活率比較 (±s，%，n=16)Table 3 Comparison of cell survival rates among various cell groups

注:與缺血再灌注組比較，*P＜0．05

組別 細胞存活率缺血再灌注組 55±6 p65 siRNA轉染組 89±10*缺血再灌注+p65 siRNA轉染組 70±9*F 值0．001 22．369 P值

在小鼠肝損傷模型中，肝臟炎癥損傷組織中CXCL16表達水平增高，膜結合和分泌型CXCL16分別介導了對淋巴細胞的趨化和內皮細胞的黏附［5］。而且，在該模型使用抗CXCL16抗體可顯著改善炎癥反應、降低丙氨酸氨基轉移酶、減輕肝損傷，提示CXCL16在組織炎癥損傷中起重要作用。CXCR6是目前所知的CXCL16的惟一受體。CXCR6基因敲除小鼠較野生株有更強的抗缺血再灌注損傷作用，心肌梗死面積小，心功能相對好，反映了CXCL16/CXCR6信號級聯在缺血再灌注中的心臟保護作用［4］。本研究通過體外對HUVEC進行模擬缺血再灌注培養，發現模擬缺血再灌注培養能誘導CXCL16 mRNA表達水平上升。值得注意的是，本研究發現體外模擬缺血再灌注可刺激p65，p65是參與組成核因子κB的重要亞基，核因子κB是眾所周知的調控炎癥反應的核心轉錄因子。本研究進一步采用siRNA方法來探索是否核因子κB p65參與了缺血再灌注刺激下對CXCL16表達水平的調節。RNA干擾 (RNAi)是指內源性或外源性雙鏈RNA介導的細胞內某特定基因的mRNA發生特異性降解，從而導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表型抑制的現象。因為RNAi技術能高效、特異地使相應基因失活，目前已作為一種簡單有效的替代基因敲除的有力工具［6］。本研究中通過siRNA沉默p65基因，特異性阻斷其分子生物學作用，導致缺血再灌注情況下CXCL16的表達受到抑制，提示核因子κB對CXCL16的調控作用。WST-1法顯示，模擬缺血再灌注不利于細胞生存，而選擇性沉默p65卻能顯著減少細胞死亡率，提示p65可能通過促炎反應等一系列機制促進細胞在缺血再灌注中的損傷。Izquierdo等［7］報道核因子κB可介導CXCL16 mRNA轉錄增加促進急性腎損傷中的炎癥反應。本研究顯示了模擬缺血再灌注情況下核因子κB介導CXCL16的表達增加，不利于細胞存活。CXCL16可能作為核因子κB的下游分子發揮作用，即核因子κB可以調節CXCL16促炎，反過來，CXCL16也可以通過核因子κB來發揮炎性效應。例如，CXCL16經由細胞外調節蛋白激酶 (ERK)/IκB激酶/IκB途徑活化核因子κB，誘導腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達促進炎癥反應、加重細胞和組織損傷［8］。此外，CXCL16還可通過Akt/蛋白激酶B(PKB)間接調節核因子 κB活化［9］。

總之，使用siRNA下調人臍靜脈內皮細胞p65的表達，可抑制模擬缺血再灌注誘導的內皮細胞CXCL16的表達，促進細胞存活。CXCL16參與缺血再灌注損傷的細胞信號轉導途徑十分復雜，其具體機制尚有待于進一步深入研究。

本課題人員貢獻:曾敏負責文章書寫及部分實驗操作;魏欣負責文章修改及部分實驗操作;李偉、符秀虹、蒙緒卿負責實驗指導及部分實驗操作;陳積雄、王萍負責實驗操作。

本研究創新之處:本研究探討核因子 κB、CXCL16促進炎癥反應導致缺血再灌注損傷的分子機制，顯示了對人臍靜脈內皮細胞進行模擬缺血再灌注培養能誘導CXCL16 mRNA的表達水平;此外，在模擬缺血再灌注中，CXCL16作為核因子κB的下游分子而發揮作用。

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